孫慶文，王悅云，徐文芬，何順志，溫芳芳（貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，貴陽 550002）

“黔黨參”又名“貴州黨參”、“臭參”等，為桔?？泣h參屬植物管花黨參Codonopsis tubulosa Kom.的干燥根。其體結(jié)實肥壯，質(zhì)堅而木質(zhì)不重，有香氣，嚼之能化渣，曾是歷史上有名的“敘黨”，享有較高聲譽。該藥材為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版收載品種，具有補中益氣、健脾益肺等功效，用于治療脾胃虛弱、氣短心悸、食少便溏、虛喘咳嗽、內(nèi)熱消渴等證[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，黔黨參還具增強造血功能、抗血栓、調(diào)血脂、抗心肌缺血缺氧、改善血液循環(huán)、增強機體免疫力等作用。黔黨參為貴州的道地藥材，在民間常作為黨參入藥使用，其原植物管花黨參在貴州西北部分布廣、適應(yīng)性強、產(chǎn)藏量大，具有廣闊的開發(fā)利用前景。筆者采用高效液相色譜（HPLC）法對黔黨參的化學(xué)成分指紋圖譜進行研究[2-13]，以期對其質(zhì)量進行較為全面、客觀地評價，為其質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀、化學(xué)工作站（美國Agilent公司）；AG135型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；CSF-1 B型超聲波清洗儀（上海超聲波儀器廠，功率：100 W，頻率：50 kHz）；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 A版、2004 B版（國家藥典委員會，以下簡稱“指紋圖譜軟件”）。

1.2 試劑

黨參炔苷對照品（江西本草天工科技有限責(zé)任公司，純度＞98%）；乙腈為色譜純，正丁醇、甲醇、乙醇、磷酸、冰醋酸均為分析純，水為重蒸水。

1.3 藥材

10批藥材樣品均由筆者于2009年7月采集，并經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院何順志教授鑒定為管花黨參C.tubulosa Kom.的干燥根，憑證標(biāo)本存放于貴陽中醫(yī)學(xué)院標(biāo)本館。鮮品采回后洗凈，60℃烘干，粉碎過40目篩，置干燥器中，備用。樣品產(chǎn)地及編號如下：貴州威寧縣馬擺大山（S1），貴州威寧縣黑石鎮(zhèn)（S2），貴州清鎮(zhèn)市站街鎮(zhèn)（S3），貴州清鎮(zhèn)市麥格鄉(xiāng)（S4），貴州普安縣盤水鎮(zhèn)（S5），貴州貴陽市金華鎮(zhèn)（S6），貴州大方縣鳳山鄉(xiāng)（S7），貴州大方縣百納鄉(xiāng)（S8），貴州畢節(jié)市朱昌鎮(zhèn)（S9），貴州織金縣珠藏鎮(zhèn)（S10）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：依利特-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10min，2%→5%A；10～30min，5%→6%A；30～55min，6%→12%A；55～65 min，12%→16%A；65～100 min，16%→17%A；100～120 min，17%→25%A；120～165 min，25%→80%A）；流速：0.8 ml/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30℃；進樣量：20μl。

2.2 對照品溶液的制備

取黨參炔苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成每1 ml含黨參炔苷0.1 mg的溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇超聲提取3次（30、30、30 ml），每次30 min，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑，殘渣用水溶解后，以水飽和正丁醇分別萃取4次（40、30、30、20ml），合并提取液，揮干正丁醇，殘渣用甲醇溶解、轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 精密度試驗

取同一供試品溶液適量，連續(xù)進樣6次，在上述色譜條件下測定，所得圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件（2004 A版）進行分析，可得相似度計算結(jié)果均＞0.999，表明本方法精密度良好，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.5 重復(fù)性試驗

取同一樣品粉末6份，每份約5 g，精密稱定，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，所得圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件（2004 A版）進行分析，可得相似度計算結(jié)果均＞0.995，表明本方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液適量，在上述色譜條件下，分別于0、6、12、24 h依法測定，所得圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件（2004 A版）進行分析，可得相似度計算結(jié)果均＞0.980，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.7 樣品測定

取10批黔黨參藥材樣品，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，取空白溶劑、黨參炔苷對照品溶液及供試品溶液，分別注入HPLC儀測定，記錄190 min的色譜圖，即得。

2.8 指紋圖譜共有峰的確定

將10批黔黨參藥材樣品的HPLC圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件（2004 A版），經(jīng)設(shè)定參照譜及自動匹配，對其峰數(shù)、峰值（積分值）和峰位（相對保留時間）等相關(guān)參數(shù)進行分析、比較，制定優(yōu)化的指紋圖譜。確定13個峰為共有峰，根據(jù)黨參炔苷對照品HPLC圖與供試品HPLC圖對應(yīng)色譜峰的保留時間及紫外光譜圖比較結(jié)果，確認9號峰為黨參炔苷峰，并設(shè)定其為參照峰。計算可得，13個共有峰峰面積的RSD為49.67%～100.93%，峰面積比值的RSD為40.86%～127.97%；共有峰的相對保留時間為0.441～1.675，相對保留時間的RSD為0.11%～1.50%。10批黔黨參藥材樣品的HPLC指紋圖譜及其共有模式見圖1；對照指紋圖譜見圖2。

3 討論

由圖1可知，10批黔黨參藥材樣品指紋圖譜中主要色譜峰的整體圖貌基本一致；從相似度評價結(jié)果來看，不同產(chǎn)地黔黨參藥材指紋圖譜的相似度均在0.923以上，相似度較高，且每批藥材13個共有峰相對保留時間的RSD均＜3%，表明本方法建立的黔黨參藥材對照指紋圖譜具有較好的代表性和重復(fù)性，為該藥材的質(zhì)量控制提供了有效的信息。但從其共有峰的峰面積比值計算結(jié)果來看，同一采收時間不同產(chǎn)地黔黨參所含成分的含量差異相對較大，表明黔黨參所含成分含量受地域性差異影響較明顯。

圖1 10批黔黨參藥材樣品的HPLC指紋圖譜及其共有模式（中位數(shù)法）Fig 1 HPLC fingerprints of 10batches of C.tubulosa and common pattern（median method）

圖2 對照指紋圖譜（中位數(shù)法）9.黨參炔苷Fig 2 Contrast fingerprints（median method）9.lobetyolin

另外，筆者還將在市場購買的其他黨參藥材——洛龍黨參（S11）、潞黨（S12）、甘肅黨參（S13），照上述方法測定并記錄HPLC圖，分別導(dǎo)入指紋圖譜軟件（2004 B版）進行分析，并與黔黨參對照指紋圖譜比較，其相似度評價計算結(jié)果分別為甘肅黨參0.522、潞黨0.093、洛龍黨參0.121。同屬其他黨參藥材與黔黨參的指紋圖譜相似度較低，表明它們之間的化學(xué)成分差異較大，所建立的黔黨參對照指紋圖譜具有較強的專屬性。黔黨參與其他品種黨參藥材的原始圖譜比較見圖3。

圖3 黔黨參與其他品種黨參藥材的原始圖譜比較Fig 3 Original map of C.tubulosa and other variety

在本試驗中，筆者分別采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%冰醋酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫。結(jié)果表明，流動相為乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液時的洗脫效果差異不甚明顯，色譜峰分離情況不夠好；流動相為甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液和甲醇-水的洗脫效果較差；流動相為乙腈-0.2%冰醋酸水溶液時各色譜峰分離度大，峰形也較好，故選擇之。

筆者分別采用依利特-C18（250mm×4.6mm，5μm）、Agilent Zorbax Extend-C18（250mm×4.6mm，5μm）、Agilent Zorbax SB-C18（250mm×4.6mm，5μm）和 Diamonsil（鉆石）-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱進行洗脫，結(jié)果表明采用依利特-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱所得譜峰最多，各色譜峰分離度大，且峰形最好，故選擇之。

本試驗采用二極管陣列檢測器同時考察5個波長——220、240、254、270、300 nm的色譜峰分離情況，發(fā)現(xiàn)在220 nm波長處色譜峰分離不好，且漂移現(xiàn)象嚴(yán)重；240 nm和254 nm波長處雖然漂移不嚴(yán)重，但色譜峰分離也不好；在270 nm和300 nm波長處的色譜峰分離較好，但在300 nm波長處檢測的色譜峰個數(shù)不及270 nm波長處多，故選擇270 nm作為檢測波長。

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