韓憲忠，金蜀蓉，柯昌毅，謝劍鋒（重慶市第三人民醫(yī)院，重慶 400014）

鼻炎是發(fā)生在鼻腔黏膜的炎性疾病，為耳鼻喉科常見(jiàn)病、多發(fā)病。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為鼻內(nèi)發(fā)癢、打噴嚏、流清鼻涕、鼻堵塞等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。古方“蒼耳散”具有散風(fēng)祛濕、通九竅、抗菌等作用，治療鼻炎效果顯著[2]。筆者根據(jù)臨床需要，結(jié)合現(xiàn)代中醫(yī)藥理論，參考古方“蒼耳散”與“鼻康合劑”處方并進(jìn)行加減，重新組方并精制成了復(fù)方芩蒼鼻噴霧劑。為保證該制劑的質(zhì)量，本試驗(yàn)建立了復(fù)方芩蒼鼻噴霧劑中黃芩苷的含量測(cè)定方法。

1 材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜（HPLC）儀，含1525二元泵、2487雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、717自動(dòng)進(jìn)樣器、Breeze色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；AR1140電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ-500超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司，功率：500 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方芩蒼鼻噴霧劑（重慶市第三人民醫(yī)院自制，批號(hào)：110112、110113、110119）；黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-200815）；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。試驗(yàn)前所有液體試劑均經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜濾過(guò)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2，V/V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：20℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取黃芩苷對(duì)照品3.10 mg，置于10 ml量瓶中，用少量甲醇經(jīng)超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得310 μg/ml的對(duì)照品貯備液。再精密量取該貯備液2 ml，置于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得62 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品2 ml，置于100 ml量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 ml，置于50 ml量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

以相同處方比例的空白輔料制得空白樣品，照“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖。結(jié)果，理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)為4564，表明柱效良好。

2.6 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

參照2010年版《中國(guó)藥典》（一部）黃芩藥材的含量測(cè)定方法，選擇280 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.7 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取上述對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件注入HPLC儀，繪制色譜圖。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照在與黃芩苷對(duì)照品色譜圖相應(yīng)位置上未見(jiàn)干擾；供試品在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)保留時(shí)間位置上有相應(yīng)的色譜峰，并且與相鄰峰有較好的分離。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.8 線性關(guān)系考察

分別精密量取質(zhì)量濃度為310 μg/ml的黃芩苷對(duì)照品貯備液0.2、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0ml，置于10ml量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為 6.2、31.0、62.0、124.0、310.0μg/ml的系列溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μl，測(cè)定峰面積。以黃芩苷進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝40248 x－72915（r＝0.9993，n＝6）。結(jié)果表明，黃芩苷的質(zhì)量濃度在6.2～310.0 μ g/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.9 精密度試驗(yàn)

精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液（62 μg/ml）連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μl，記錄色譜圖。結(jié)果，RSD＝1.04%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取同一批樣品2 ml，共6份，分別置100 ml量瓶中，照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬定方法進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果，樣品中黃芩苷的平均質(zhì)量濃度為24.60μg/ml，RSD＝1.69%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.11 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取同一供試品溶液適量，分別于0、4、8、16、24 h時(shí)按擬定方法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，RSD＝0.56%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.12 加樣回收率試驗(yàn)

取已知黃芩苷含量的同一批樣品0.1 ml，共9份，每3份為一組，分別按低、中、高質(zhì)量濃度精密加入黃芩苷對(duì)照品貯備液各適量，照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬定方法測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.13 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，分別照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各取10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別進(jìn)樣3次，記錄色譜圖，并以外標(biāo)法計(jì)算樣品中黃芩苷的質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determination of samples（n＝3）

3 討論

HPLC法分離效能高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣，其重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度均優(yōu)于薄層色譜掃描法，現(xiàn)已作為中藥及其制劑的常規(guī)含量測(cè)定方法[3]。黃芩苷為含羥基的黃酮類(lèi)化合物[4]，極性較大。筆者通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的多種流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，并參考2010年版《中國(guó)藥典》[5]，以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2，V/V/V）為流動(dòng)相，其中磷酸可作為解離抑制劑，抑制組分解離，增強(qiáng)保留[6]。該條件下黃芩苷峰與相鄰峰能較好的分離，對(duì)稱(chēng)性好，故選用此流動(dòng)相。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)黃芩苷的保留時(shí)間有一定影響：當(dāng)溫度在20℃左右時(shí)，黃芩苷的保留時(shí)間在10.2 min左右；當(dāng)溫度在30℃左右的時(shí)候，黃芩苷的保留時(shí)間會(huì)降至7.6 min左右。Yang Y等[7]發(fā)現(xiàn)隨著柱溫的升高，極性和非極性物質(zhì)的保留因子都減小。因此，為了保證色譜峰出峰時(shí)間的一致性，如沒(méi)有溫箱，應(yīng)盡量保證柱溫的相對(duì)一致性，以減少由于溫差造成保留時(shí)間的較大變化。

試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于復(fù)方芩蒼鼻噴霧劑中黃芩苷的含量測(cè)定和該制劑的質(zhì)量控制。

[1]張羅，韓德明，王琪，等.鼻炎概述[J].中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科，2007，14（1）：19.

[2]李宏偉.辛夷蒼耳散加減治療急慢性鼻竇208例觀察[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師，2010，13（12）：123.

[3]黃其春，徐文升.HPLC法測(cè)定痰熱清注射液中黃芩苷的含量[J].中國(guó)藥房，2008，19（30）：2388.

[4]江紀(jì)武，肖慶祥.植物有效成分手冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1986：111.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：391.

[6]李發(fā)美.分析化學(xué)[M].6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：398.

[7]Yang Y，Jones AD，Eaton CD.Reerention behavior of phenols，anilines，and alkylbensenes in liquid chromatographic separations using subcritical water as the mobile phase[J].Anal Chem，1999，71（17）：3808.