姜 雪,高玉偉,胡桂學(xué),楊松濤,趙艷麗,劉秋燕,徐春忠,梁秀娟,夏咸柱

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)春 130118;2.解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所,長(zhǎng)春 130062;3.上海野生動(dòng)物園,上海 201300；4.吉林省野生動(dòng)物救護(hù)繁育中心,長(zhǎng)春 130122)

貓杯狀病毒(feline calicivirus,FCV)為單股正鏈RNA,無囊膜,直徑30～40 nm[1],是一種貓和部分貓科動(dòng)物普遍存在的病原體.易感動(dòng)物感染FCV后表現(xiàn)為口腔潰瘍、上呼吸道感染、慢性口炎、鼻炎、結(jié)膜炎、肺炎或跛行等臨床癥狀[2-3]，其臨床癥狀的多樣性取決于FCV基因的多樣性[4],與由貓皰疹病毒(FHV)引起的貓傳染性鼻炎相似,二者也?；旌细腥綶5].高致病性FCV可引起動(dòng)物全身性感染,甚至死亡.感染FCV的貓一部分恢復(fù)健康,另一部分成為無癥狀的病原攜帶者[6].檢測(cè)FCV的方法有病毒分離鑒定和血清學(xué)實(shí)驗(yàn),對(duì)分離的病毒可通過電鏡檢查、RT-PCR、熒光定量PCR鑒定或與已知抗血清做中和、瓊擴(kuò)、免疫熒光或補(bǔ)結(jié)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定[1].其中熒光定量PCR方法應(yīng)用廣泛[7-12],如Sykes等[13-14]建立了對(duì)FCV檢測(cè)的普通PCR方法;Helps等[15]用染料法建立了FCV熒光定量PCR檢測(cè)方法;Wilhelm等[16]以FCV的ORF2為目的基因建立了熒光定量PCR方法檢測(cè)FCV,最低檢測(cè)范圍為(5×101～5×102)拷貝/μL.本文通過優(yōu)化FCV熒光定量PCR條件,為臨床樣品的檢測(cè)提供準(zhǔn)確而快速的檢測(cè)方法.

1 材料與方法

1.1 毒株和細(xì)胞

FCV由軍事獸醫(yī)研究所于2012年分離自國(guó)內(nèi)某患病死亡的虎；貓鼻氣管炎病毒(FRtV)、貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(FPV)和貓腎細(xì)胞(F81)均為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 主要儀器和試劑

德國(guó)Tiangen公司生產(chǎn)的Agilent Mx3000P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀;美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的PCR儀;德國(guó)Bio-Lmaging Systems公司生產(chǎn)的凝膠成像系統(tǒng);美國(guó)Qnawell公司生產(chǎn)的核酸蛋白分析儀.

質(zhì)粒小提試劑盒(D100)和瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒(D100)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AT301)和pEASY-Blunt載體(CB101-01)購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司;TRIZOL試劑(D9108A)、Pfu酶(D7336)、大腸桿菌感受態(tài)DH5α(D9057)、DL 2000 DNA Marker(D501S)和熒光定量PCR試劑盒(DRR390)等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司.

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中編碼FCV衣殼蛋白ORF2的保守區(qū)基因序列,利用Primer5.0軟件,設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物及探針.上游引物：5′-CTGACTTCAAATTTCATCTC-3′;下游引物：5′-TGGGAATTAAGTCAGAGG-3′;探針：5′-(FAM)ATCTATGCTCACTCATGGATCTGTC(Eclipse)-3′.探針以FAM為報(bào)告基團(tuán),以Eclipse為淬滅基團(tuán).引物及探針均由大連寶生物工程有限公司合成.

1.4 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的制備

用FCV病毒接種F81細(xì)胞,待細(xì)胞出現(xiàn)80%病變(CPE)后,反復(fù)凍融3次,收獲細(xì)胞毒.用TRIZOL法提取細(xì)胞毒RNA,提取產(chǎn)物直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得病毒cDNA作為擴(kuò)增模板.反轉(zhuǎn)錄體系：總RNA模板5 μL,隨機(jī)引物1 μL,2×TS反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液10 μL,反轉(zhuǎn)錄酶RT 1 μL,去RNA酶水(DEPC)處理水補(bǔ)到20 μL.反應(yīng)條件：25 ℃孵育10 min,42 ℃孵育30 min,85 ℃加熱5 min.PCR擴(kuò)增體系：cDNA模板3 μL,5倍Pfu緩沖液10 μL,dNTP 3 μL,上游引物F 1 μL,下游引物R 1 μL,Pfu酶0.5 μL,DEPC處理水補(bǔ)到29.5 μL.PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s,59.3 ℃ 20 s,72 ℃ 75 s,30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min,4 ℃保溫.以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后,利用凝膠回收試劑盒獲得FCV病毒ORF2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,將回收的產(chǎn)物連接pEASY-Blunt載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽(yáng)性克隆菌搖菌,提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定.測(cè)定其OD值,并根據(jù)公式計(jì)算重組質(zhì)粒的DNA質(zhì)量濃度與純度.將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋,保存?zhèn)溆?

分子拷貝數(shù)(個(gè)/mL)=DNA質(zhì)量濃度/DNA分子量,DNA分子量=DNA堿基數(shù)×660,DNA質(zhì)量濃度=A260g/μL×稀釋倍數(shù)×6.02×1023.

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

反應(yīng)體系：DNA模板2 μL,EXTaq酶預(yù)混液12.5 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,探針1.0 μL,DEPC處理水補(bǔ)到25 μL.在Agilent Mx3000P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上反應(yīng),反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s,94 ℃ 5 s,55 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,45個(gè)循環(huán)；退火期收集熒光信號(hào).用矩陣法在引物濃度為0.16,0.20 μmol/L,探針濃度為0.32,0.40,0.48,0.56 μmol/L的反應(yīng)體系篩選引物和探針的最佳使用量,以獲得最低Ct值、典型熒光擴(kuò)增曲線、較高熒光強(qiáng)度的引物和探針最佳濃度.

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

實(shí)驗(yàn)采用已優(yōu)化的熒光定量PCR反應(yīng)條件,分別以梯度濃度稀釋的含目的基因質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,并利用Agilent Mx3000P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀軟件進(jìn)行分析,選取最佳濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.7 特異性實(shí)驗(yàn)及靈敏度與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

用所建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)FCV,FRtV,FPV,用雙蒸餾水作為陰性對(duì)照,以檢測(cè)其特異性.

將已計(jì)算出拷貝數(shù)的含目的基因質(zhì)粒做10倍梯度稀釋,稀釋至用熒光定量PCR儀不能檢出的稀釋倍數(shù),計(jì)算熒光定量PCR所能檢測(cè)的最低模板拷貝數(shù).對(duì)同一陽(yáng)性樣品進(jìn)行4次重復(fù)檢測(cè),通過組內(nèi)重復(fù)的熒光擴(kuò)增曲線變化及Ct值變化評(píng)估該方法的重復(fù)性.

1.8 疑似臨床樣本的檢測(cè)

用所建立的熒光PCR方法,對(duì)從長(zhǎng)春市某寵物醫(yī)院收集的24份疑似FCV患病貓的咽試子樣本進(jìn)行檢測(cè).

1.9 病毒的分離與鑒定

將熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的咽試子加適量DMEM稀釋后,于12 000 r/min離心10 min,取上清液加每毫升1 600單位的雙抗處理后接種單層F81細(xì)胞,盲傳5代觀察細(xì)胞是否產(chǎn)生特征性病變.對(duì)產(chǎn)生特異性病變的細(xì)胞反復(fù)凍融3次收取病毒液,進(jìn)行RT-PCR鑒定.根據(jù)GenBank中已發(fā)布的FCV病毒ORF3基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,預(yù)期擴(kuò)增片段為550 bp,由北京博士生物公司合成.上游引物5′-TCCTTYGCAGTYTATAGAATAATTG-3,下游引物5′-TTATATCCCTGGGGTTAGGC-3′,Y: C/T.用TRIZOL法提取細(xì)胞毒的RNA,提取產(chǎn)物直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得病毒cDNA作為擴(kuò)增模板.反轉(zhuǎn)錄過程按說明書操作.PCR擴(kuò)增體系：DNA模板2 μL,10×Taq緩沖液2.5 μL,dNTP 2 μL,上游引物F 0.5 μL,下游引物R 0.5 μL,ExTaq酶0.3 μL,DEPC處理水補(bǔ)到25 μL.PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min,4 ℃保溫.反應(yīng)結(jié)束后,取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定.

2 結(jié) 果

2.1 熒光PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

圖1 引物和探針濃度的優(yōu)化Fig.1 Optimization of the concentrations of primer and probe

采用矩陣法選取引物和探針的最佳濃度,結(jié)果如圖1所示.在c(引物)=0.20 μmol/L和c(探針)=0.40 μmol/L的條件下,對(duì)含目的基因質(zhì)粒的檢測(cè)可獲得較合適的Ct值和較大的ΔRn.優(yōu)化的熒光定量PCR反應(yīng)條件為: 95 ℃ 30 s,95℃ 5 s,55 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,循環(huán)數(shù)為45,退火階段收集熒光信號(hào).

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按已優(yōu)化反應(yīng)條件,對(duì)103,104,105,106,107和108六個(gè)梯度含目的基因的質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖2所示.由圖2可見,反應(yīng)結(jié)束后所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈較好的線性關(guān)系.相應(yīng)的拷貝數(shù)X與Ct值的線性關(guān)系為Ct=-3.288xlgX+46.72.

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

用建立好的方法對(duì)FCV,FRtV,FPV的核酸及雙蒸餾水進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果如圖3所示.由圖3可見,僅FCV產(chǎn)生熒光信號(hào),呈現(xiàn)良好的特異性.

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of real time PCR

圖3 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Test of specificity

2.4 敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將計(jì)算出拷貝數(shù)的質(zhì)粒做10倍系列稀釋,進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖4所示.由圖4可見,熒光定量PCR檢測(cè)到的最低濃度為2.26×101拷貝/μL,表明該方法具有較高的靈敏度.

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行4次重復(fù)檢測(cè),結(jié)果如圖5所示.通過統(tǒng)計(jì)分析可得變異系數(shù)為2.158%,表明該方法具有較好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性.

圖4 敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Test of sensibility

圖5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Curves of repeat test

2.6 疑似臨床樣品的檢測(cè)及病毒分離鑒定結(jié)果

M：DL 2000分子量標(biāo)準(zhǔn);1,2,3：PCR產(chǎn)物；4：陰性對(duì)照.圖6 RT-PCR結(jié)果Fig.6 Result of RT-PCR

用優(yōu)化后的熒光定量PCR方法對(duì)24份疑似患FCV病貓的唾液樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果為陽(yáng)性樣本3份,陰性樣本21份,FCV的檢出率為12.5%.采用F81細(xì)胞從熒光定量PCR陽(yáng)性樣本中分離病毒,3 d后,細(xì)胞均出現(xiàn)圓縮、葡萄串樣和細(xì)胞脫落等病變.采用普通RT-PCR鑒定細(xì)胞培養(yǎng)物,結(jié)果均獲得預(yù)期核苷酸片段,如圖6所示.因此,本文建立的熒光定量PCR方法可較敏感地檢測(cè)出陽(yáng)性樣本.

綜上可見,本文建立的FCV熒光定量PCR方法,檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系為0.992,最低檢測(cè)為2.26×101拷貝/μL,具有較高的敏感性；特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法僅能檢測(cè)FCV,無法檢測(cè)其他相關(guān)病毒,呈現(xiàn)出良好的特異性；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明,批內(nèi)變異系數(shù)為2.158%,重復(fù)性較好；臨床疑似樣品的檢測(cè)率為12.5%,與文獻(xiàn)[17]結(jié)果相符.

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