金歡馳, 張玉玲, 黨江艷

(吉林大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院, 水資源與環(huán)境研究所, 長春 130012)

微生物修復(fù)是一種低能耗處理石油污染地下水的有效方法[1]. 但土著微生物生長緩慢, 且數(shù)量有限, 使生物修復(fù)過程受限. 通過人工富集降解石油類土著微生物, 發(fā)揮其最大效能, 是提高石油污染地下水生物修復(fù)效率的主要方法[2]. 苯是石油污染組分中的常見物質(zhì), 由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)及易遷移的特點, 在自然環(huán)境中不易降解. 目前, 苯降解菌的研究主要為苯降解菌菌株的篩選鑒定、 降解影響因素、 降解酶的基因組學(xué)以及理論微生物降解途徑[3-5]等. Caldwell等[6]通過檢測苯降解過程的中間產(chǎn)物, 提出了苯轉(zhuǎn)化為苯甲酸的厭氧生物降解途徑； 文獻[7-8]分別采用高效液相色譜(HPLC)和紅外分析檢測苯降解的中間產(chǎn)物, 推測了苯的生物降解途徑及化學(xué)催化氧化途徑. 本文在采集樣品并分離出苯降解菌的基礎(chǔ)上, 模擬低溫地下水環(huán)境條件, 研究降解菌的代謝機制, 并推測苯降解菌在低溫環(huán)境中的代謝特征.

1 實 驗

1.1 儀器和試劑

HZQ-QX型全溫振蕩器(上海博訊實業(yè)有限公司)； RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)； OI4560型吹掃捕集儀(美國OI公司); Agilent 6890/5973 GC-MS型氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)； CH2O型電子顯微鏡(德國OLYMPUS公司). 所用主要化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純, 苯標(biāo)準品購自國家標(biāo)準物質(zhì)中心.

液體培養(yǎng)基： NH4NO32 g, K2HPO41.5 g, KH2PO43 g, MgSO4·7H2O 0.1 g, 無水CaCl20.01 g, Na2EDTA·2H2O 0.01 g, 苯 1 mL, 蒸餾水 1 L. 固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入10 g瓊脂.

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種來源 菌種來源于東北某油田區(qū)石油類污染淺層地下水, 主要特征污染物為苯[9].

1.2.2 苯降解菌的富集純化 將1 mL石油污染地下水置于液體培養(yǎng)基中, 密封, 于10 ℃,100 r/min培養(yǎng)至液體變渾濁, 每隔3～4 d將0.5 mL菌懸液轉(zhuǎn)移至150 mL液體培養(yǎng)基中, 共轉(zhuǎn)移5次； 采用稀釋涂布法, 先將富集后的培養(yǎng)液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上, 再將浸有苯液的棉花置于培養(yǎng)皿蓋一側(cè), 密閉倒置培養(yǎng)皿, 10 ℃培養(yǎng)2 d后挑選單菌落, 畫線分離, 得到6株以苯為唯一碳源和能源的菌株B1～B6.

1.2.3 石油污染地下水微環(huán)境模擬實驗 挑取單菌落置于裝有150 mL石油污染地下水(400 mg/L苯)的密閉玻璃瓶中, 空白溶液作為對照, 每組做3個平行樣. 在10 ℃,100 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中放置3 d, 取1 mL上清液, 稀釋1 000倍后利用吹掃捕集-氣質(zhì)聯(lián)儀測試苯的質(zhì)量濃度, 確定苯的優(yōu)勢降解菌.

1.2.4 優(yōu)勢菌種降解苯的代謝產(chǎn)物檢測

1) 優(yōu)勢苯降解菌生長曲線的繪制及兒茶酚雙加氧酶的活性檢測： 將0.5 mL菌懸液置于液體培養(yǎng)基中, 在10 ℃,100 r/min條件下培養(yǎng), 每組做3個平行樣, 采用分光光度法測試微生物的OD660值, 繪制生長曲線, 并參照文獻[10-11]方法測試兒茶酚1,2-雙加氧酶和兒茶酚2,3-雙加氧酶的活性.

2) 雙加氧酶的檢測： 將0.002 0 g兒茶酚溶于蒸餾水中, 取2滴置于0.5 mL的發(fā)酵液中, 密封, 觀察兒茶酚溶液顏色和發(fā)酵液溶液顏色的變化.

3) 代謝產(chǎn)物檢測： 采用微環(huán)境降解實驗溶液, 通過兩種方式檢測降解代謝產(chǎn)物.

① 利用吹掃捕集儀和氣質(zhì)聯(lián)用儀對樣品進行全掃描和測試, 并分析質(zhì)譜中苯降解后的分子碎片峰;

② 將10 mL發(fā)酵液和3 mL二氯甲烷置于50 mL分液漏斗中, 振搖3 min, 取上層有機相過無水硫酸鈉, 經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液濃縮至1 mL, 用氣質(zhì)聯(lián)用儀全掃描分析.

儀器測定條件參見文獻[12].

1.2.5 優(yōu)勢菌種的生理生化特性檢測 根據(jù)菌種特性, 主要進行三糖鐵實驗、 葡萄糖發(fā)酵實驗、 甲基紅實驗、 吲哚實驗、 產(chǎn)氨實驗、 檸檬酸鹽利用實驗、 油脂水解實驗、 淀粉水解實驗、 明膠液化實驗、 V.P實驗、 3-酮基乳糖測定實驗、 纖維素水解實驗、 產(chǎn)硫化氫實驗、 氧化酶實驗、 接觸酶實驗、 硝酸鹽還原實驗、 亞硝酸鹽還原和反硝化實驗.

1.2.6 菌種鑒定

1) 菌株顯微鏡下形態(tài)表征： 采用革蘭氏染色實驗鑒定菌種.

2) 菌種基因鑒定： 采用熒光定量PCR儀進行16S rDNA擴增, 在上海生物工程有限公司測序.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的篩選結(jié)果與分析

實驗采用廢棄井返水事故產(chǎn)生的含水層地下水(主要為Ca-Na-HCO3-Cl型水), 水樣中總石油烴(TPH)的質(zhì)量濃度為36 mg/L[9]. 本文模擬地下水中的微生物處于寡營養(yǎng)狀態(tài), 使其生長環(huán)境與淺層地下水環(huán)境接近. 苯的初始質(zhì)量濃度為394.36 mg/L, 6種菌在微環(huán)境中生長繁殖后, 在第3天取樣測試, 水相體系中苯的質(zhì)量濃度測試結(jié)果如圖1所示. 由圖1可見, 6種菌均有降解苯的能力, 其中B6菌降解效果最好, 降解率為82.82%. 因此以B6菌為考察對象進行代謝特征研究.

2.2 B6菌降解苯過程中代謝物質(zhì)分析

2.2.1 兒茶酚降解酶的活性檢測 B6菌的生長曲線及兒茶酚降解酶的活性測定結(jié)果如圖2所示. 由圖2可見, 在B6菌的生長期內(nèi), 兒茶酚2,3-雙加氧酶的活性基本為零, 表明在該實驗條件下, 兒茶酚2,3-雙加氧酶基本未參與苯的生物降解. 兒茶酚1,2-雙加氧酶的活性在該過程中逐漸升高, 3 d后逐漸下降, 與B6菌的生長曲線一致. 因此, 在B6菌降解苯過程中, 產(chǎn)生了兒茶酚1,2-雙加氧酶.

圖1 6種降解菌對苯的降解效果Fig.1 Biodegradation of benzene by six isolated-strains

圖2 B6菌的生長曲線及兒茶酚降解酶的活性測定Fig.2 Growth curves of B6 and the enzyme activity of catechol dioxygenase

2.2.2 雙加氧酶的檢測分析 所有芳香族化合物均先降解為兒茶酚, 在雙加氧酶的作用下, 兒茶酚發(fā)生裂解, 使苯環(huán)斷裂[10,13]. 實驗中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過較短時間發(fā)酵液變?yōu)辄S色, 表明兒茶酚已被雙加氧酶氧化, 從而證實苯系物降解途徑包括兒茶酚降解.

圖3 采用二氯甲烷萃取后B6菌全掃描色譜Fig.3 Full-scan spectrum of B6 strain extracted by methylene chloride

2.2.3 菌種代謝物的檢測分析 采用吹掃捕集-GC/MS直接吹掃、 二氯甲烷萃取液和正己烷萃取液定性檢測方法, 分析B6菌代謝產(chǎn)物, 在直接吹掃和正己烷萃取液定性檢測譜中未發(fā)現(xiàn)代謝中間產(chǎn)物的衍生物質(zhì), 而在經(jīng)二氯甲烷萃取的溶液中發(fā)現(xiàn)了代謝中間產(chǎn)物的衍生物質(zhì), 測試結(jié)果如圖3所示. 由圖3可見, 在全掃描色譜中未出現(xiàn)甲苯和二甲苯等苯系物的譜峰, 表明B6菌將苯和其他苯系物均降解了. 在經(jīng)二氯甲烷萃取后, 出現(xiàn)較多B6降解菌的中間代謝產(chǎn)物衍生物質(zhì), 如在保留時間19.73 min, 出現(xiàn)鄰苯二甲酸酯類物質(zhì), 在保留時間17.91 min, 出現(xiàn)內(nèi)酯開環(huán)后生成的丁二酸酯類物質(zhì). 因此可推測B6菌生物降解苯的途徑如圖4所示, 主要按兒茶酚正位裂解途徑進行.

圖4 苯降解途徑Fig.4 Degradation approach of benzene

2.3 優(yōu)勢菌種的生理生化特性檢測

B6菌的生理生化實驗結(jié)果列于表1. 由表1可見: B6菌在代謝過程中產(chǎn)生色氨酸酶、 脂肪酶、 淀粉酶、 明膠酶、 乳糖酶和氧化酶等, 葡萄糖、 乳糖、 蛋白質(zhì)、 色氨酸、 脂肪、 淀粉、 明膠、 多肽、 纖維素、 含硫有機物、 細胞色素C、 硝酸鹽及亞硝酸鹽為其營養(yǎng)物質(zhì)； 亞硝酸鹽為B6菌代謝的電子受體； 硝酸鹽為B6菌代謝的終末受氫體或電子受體.

表1 B6菌的生理生化實驗*

* “+”表示反應(yīng)為陽性; “-”表示反應(yīng)為陰性.

2.4 菌種鑒定結(jié)果

B6菌在顯微鏡下的形態(tài)如圖5所示. 由圖5可見, B6菌菌落形態(tài)為圓形不透明, 質(zhì)地粗糙, 淡黃色. 根據(jù)革蘭氏染色和基因鑒定結(jié)果可知, B6菌為革蘭氏陽性紅平紅球菌, 其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6所示.

圖5 B6菌在顯微鏡下的形態(tài)Fig.5 Morphology of B6 strain

圖6 B6菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of B6 strain

由圖6可見, B6菌與RhodococcuserythropolisPR4的同源性最高, 該菌可利用C8～C20的烷烴為唯一碳源和能源, 其代謝底物具有多樣性, 尤其對疏水化合物的代謝(如烴類、 煤和石油)[14].

綜上所述, 本文從石油污染的地下水樣品中富集、 純化和篩選得到一株紅平紅球菌B6, 該菌對苯具有較好的降解性能, 當(dāng)苯的初始質(zhì)量濃度為394.36 mg/L時, B6菌對苯的降解率為82.82%. B6菌在代謝過程中產(chǎn)生多種酶類物質(zhì), 利用葡萄糖、 乳糖和含硫有機物等作為營養(yǎng)物質(zhì), 亞硝酸鹽和硝酸鹽為其代謝電子受體. 通過檢測酶活及菌種代謝的中間產(chǎn)物可知, B6菌在實驗條件下對苯的生物降解途徑為兒茶酚正位裂解.

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