石向群

(九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 江西九江 332000)

甲氧芐啶，學(xué)名為2，4-二氨基-5-(3，4，5-三甲氧芐基)嘧啶，英文/拉丁名稱為T(mén)rimethoprim(TMP)，為化學(xué)合成抗菌藥， 臨床上主要用于磺胺類藥物的抗菌增效劑。陳瑞玲[1]在磺胺類藥與甲氧芐啶的合理應(yīng)用的研究中得出兩者聯(lián)合應(yīng)用，可起到減緩細(xì)菌對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性和增強(qiáng)抗菌的作用。甲氧芐啶還能與多種抗生素及中藥聯(lián)合使用，能使抗菌譜擴(kuò)大，抗菌活性大大增強(qiáng)。王新[2]等就甲氧芐啶對(duì)蒲公英體外抗菌增效作用進(jìn)行研究，得出蒲公英與甲氧芐啶聯(lián)用呈相加作用并確定甲氧芐啶對(duì)蒲公英體外抗菌增效的最佳劑量，為蒲公英與甲氧芐啶復(fù)方制劑的研制奠定基礎(chǔ)。目前，2010版藥典中收錄的此類藥物有甲氧芐啶、甲氧芐啶片和甲氧芐啶注射液[3]。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

液質(zhì)聯(lián)用儀：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1200LC-6410B QQQ，電噴霧離子源(ESI)，液質(zhì)軟件Agilent MassHunter(包含采集軟件Data Acquisition，定性軟件Qualitative Analysis，定量軟件Quangitative Data Analysis)；超純水機(jī)：KL-UP-IV-20，成都康寧；電子分析天平：BT224S，賽多利斯。

甲氧芐啶對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)、甲氧芐啶原料藥(批號(hào)2010-10014，西安藻露堂藥業(yè)公司)、甲醇(色譜純)。

1.2 方法條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18 (2.1×30mm，3.5-Micron)；流動(dòng)相：甲醇：水(50∶50)；檢測(cè)波長(zhǎng)：271nm；流速：0.2mL/min；手動(dòng)進(jìn)樣；定量環(huán)：20μL；柱溫：40℃。

1.2.2 質(zhì)譜條件 正離子模式(ESI+)，離子源溫度300℃，干燥氣流速8L/min，霧化氣壓力35psi，毛細(xì)管電壓4 000V，掃描模式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，離子對(duì)m/z(291.1→230.1)，采樣時(shí)間3min。

1.3 溶液配制

精密稱取30mgTMP對(duì)照品于50mL的容量瓶中，加入50%的甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用作儲(chǔ)備液(0.6mg/mL)。從儲(chǔ)備液中精密吸取0.5mL溶液置50mL的容量瓶中，用50%的甲醇稀釋定容，搖勻，作為母液(6μg/mL)。從母液中依次精密吸取100、180、260、340、420μL溶液于10mL容量瓶中，用50%的甲醇稀釋定容，搖勻，分別為標(biāo)1～5。

精密稱取原料藥30mg，置50mL的容量瓶中，加入50%的甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。從上述溶液中精密吸取0.5mL溶液置50mL的容量瓶中，用50%的甲醇稀釋定容，搖勻，作為供試品母液。從供試品母液中精密吸取300μL溶液于10mL容量瓶中，用50%的甲醇稀釋定容，搖勻，即得供試品溶液，平行制備3份。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1 母離子掃描與破碎電壓優(yōu)化 在全掃描(Scan)的模式下，根據(jù)TMP化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)，將掃描范圍設(shè)為m/z 100～500，通過(guò)掃描標(biāo)樣找到了母離子m/z291.1。在選擇性掃描(SIM)的模式下，分別用100、120、140、160V的破碎電壓(Fragmentor)對(duì)標(biāo)樣進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，破碎電壓為140時(shí)質(zhì)譜峰最強(qiáng)。

2.1.2 子離子掃描與碰撞能量?jī)?yōu)化 在子離子掃描(Product Lon)的模式下，根據(jù)優(yōu)化碰撞能量來(lái)尋找與母離子m/z 291.1對(duì)應(yīng)的子離子。分別用15、20、25、30的碰撞能量(Fragmentor)對(duì)標(biāo)樣進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在碰撞能量為20時(shí)，找到了與母離子m/z291.1有對(duì)應(yīng)關(guān)系的子離子m/z230.1。

2.2 定量分析

采用正離子模式(ESI+)，多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，母離子及子離子定量離子對(duì)為m/z(291.1→230.1)(如圖1所示)，以離子峰面積作為定量依據(jù)。

圖1 甲氧芐啶對(duì)照品溶液MRM多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜圖

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 按1.3項(xiàng)下配得的對(duì)照品溶液，分別按1.2項(xiàng)下方法條件依次進(jìn)樣，在MRM模式下定量分析，以濃度為橫坐標(biāo)，離子峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸(如圖2)， 得回歸方程為Y= 226.4143X+16606.3237， r=0.9967。結(jié)果表明， 甲氧芐啶在60～252ng/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖2 甲氧芐啶對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 按1.3項(xiàng)下配的標(biāo)3溶液重復(fù)進(jìn)樣測(cè)量3次，測(cè)得結(jié)果分別是148.70、153.98、149.68ng/mL，RSD%為2.80%。

2.2.3 樣品含量測(cè)定 按1.3項(xiàng)平行配制甲氧芐啶原料藥的供試品溶液3份，按1.2項(xiàng)下方法條件依次進(jìn)樣。測(cè)定結(jié)果表明：RT保留時(shí)間分別為0.501、0.503、0.497，RSD為4.90%。供試品濃度分別為172.21、164.01、169.46 ng/mL，平均濃度為168.56 ng/mL ，RSD為2.48%。原料藥甲氧芐啶含量分別為95.67%、91.11%、94.14%，平均含量為93.64% ，RSD%為2.48%。

2.2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 按1.3項(xiàng)平行配制甲氧芐啶原料藥的供試品溶液3份，分別精密吸取4mL放入3個(gè)25mL的容量瓶中，再在各瓶中加入0.2mL(6μg/mL)的標(biāo)樣母液，用50%的甲醇定容至刻度，搖勻，依次進(jìn)樣。測(cè)定結(jié)果表明：加標(biāo)溶液濃度分別為82.41、76.44、83.79 ng/mL，回收率分別為102.75、96.06、99.46%，平均回收率為99.42%，RSD%為3.36%。

3 討論

《藥典》(2010版)二部甲氧芐啶項(xiàng)下含量測(cè)定采用結(jié)晶紫作為指示劑，用高氯酸進(jìn)行滴定的測(cè)量方法。本文利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，樣品經(jīng) HPLC分離后在離子源被離子化，然后進(jìn)入質(zhì)譜中，采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，母離子m/z291.1與子離子為m/z230.1形成定量離子對(duì)。本方法專屬性強(qiáng)，選擇性高，其他組分的存在對(duì)測(cè)定沒(méi)有干擾。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳瑞玲.磺胺類藥與甲氧芐啶的合理應(yīng)用[J].中國(guó)臨床醫(yī)生，2008，36(7)：18.

[2]王新，崔一喆，邵紅，等.甲氧芐啶對(duì)蒲公英體外抗菌增效作用的研究[J].疾病防治，2010，37(2)：169.

[3]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(二部)[M].北京:化工出版社，2010.146.