錢小成，楊好強，趙鳳霞，潘紅春

(安徽師范大學生命科學學院重要生物資源保護與利用研究安徽省重點實驗室生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級重點實驗室，蕪湖241000)

刺胞動物門水螅綱的淡水水螅是適合進行形態(tài)發(fā)生和個體發(fā)育調控機制研究的重要模式生物［1-3］，因為水螅具有簡單的單個極性體軸(口區(qū)-胃區(qū)-足區(qū))［4，5］。極性體軸的一端為由口、垂唇和圍繞口邊緣著生的數(shù)根觸手構成的口區(qū)，另一端為由柄和位于身體末端的基盤構成的足區(qū)，而介于口區(qū)和足區(qū)之間的區(qū)域即為胃區(qū)，柄和胃區(qū)的交界處為無性生殖的出芽區(qū)。在自然狀態(tài)下，水螅的基盤固著于水中物體的表面、水螅體舒展伸長，其身體另一端即頭區(qū)的觸手自然延長下垂捕獲水中快速運動的小型節(jié)肢動物溞類、與此同時觸手上分布的大量刺細胞釋放刺絲囊麻醉或殺死獵物，而后觸手迅速收縮把獵物吞進胃循環(huán)腔。因此水?；P的固著行為是水螅進行正常捕食活動的前提條件。

長期以來，一直認為水螅是靠基盤粘液細胞分泌的粘液粘附于固著物表面［6-8］，但有關水?；P固著行為及機理的相關信息非常有限，比如基盤吸附面與固著物表面之間吸附力的確切來源、粘液細胞在基盤吸附面上的分布情況等目前知之甚少。本研究組在實驗室飼養(yǎng)水螅時發(fā)現(xiàn)，有時為了清潔培養(yǎng)水螅的玻璃燒杯、需要把水螅移到另外一個燒杯中，有些固著在燒杯側壁上的水螅個體與燒杯壁表面間的粘附力很強、以至于用玻璃吸管多次沖水都不能讓水螅基盤與燒杯壁分離，直至增大沖水力度導致水螅身體中間斷裂時基盤還不能與燒杯壁分離，該現(xiàn)象對基盤與固著物之間粘附力僅來自粘液的觀點提出了質疑?；P粘液細胞是水螅身體上一種特化的終端分化細胞，除了能分泌粘多糖物質到細胞外形成粘液外，它還有一個重要特征是其細胞質內表達一種水?；P特異性過氧化物酶，該酶在粘液細胞中高量表達，把水?；铙w放入含有ABTS［2，2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)］和H2O2的反應體系中，基盤中表達過氧化物酶的粘液細胞能被染成紫紅色［9］?；诖?，本研究除了詳細觀察了水?；P的固著行為、還利用上述的ABTS組織化學方法對粘液細胞在基盤吸附面上的分布模式進行了顯示，另外本文還對水?；P特異性過氧化物酶基因進行了分子克隆，期望探討該酶高量表達與基盤固著行為之間是否存在內在聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗用水螅為本實驗室培育的大乳頭水螅(Hydra magnipapillata)中國品系單克隆無性繁殖系，原種采自安徽省蕪湖市汀堂公園水塘(31°21'39.2″N，118°22'51.46″E)。水螅每天喂食一次鹵蟲無節(jié)幼體(Artemia sp.)，喂食1 h后更換培養(yǎng)液，然后維持在溫度22℃ ±0.5℃的光照培養(yǎng)箱中(光照強度=2000 LX，LD：HD=12 h ：12 h)。

1.2 水?；P固著行為及形態(tài)學觀察

借助本研究組大乳頭水螅規(guī)?；囵B(yǎng)平臺，在喂食后換培養(yǎng)液時挑取一些基盤沒有固著的水螅，置于凹玻片、再添加適量培養(yǎng)液，Olympus數(shù)碼顯微鏡下進行連續(xù)觀察和記錄。

1.3 基盤固著時基盤吸附面的組織學觀察

在水螅培養(yǎng)平臺上挑選有水螅在側壁上固著的水螅培養(yǎng)燒杯，先進行快速微波固定(微波爐頻率2450 MHZ，功率800 W)1 min，然后Bouin氏固定液再固定15～20 min，梯度酒精脫水，水螅標本定位后石蠟包埋，做7 μm厚度的切片，蘇木精及伊紅雙染，Olympus數(shù)碼顯微鏡下觀察和拍照。

1.4 基盤過氧化物酶表達的檢測

通過ABTS細胞化學染色法檢測水螅基盤粘液細胞分子標志物過氧化物酶的表達，觀察水?；P粘液細胞在基盤吸附面上分布模式。將水螅置于白色陶瓷比色板上(每孔1只水螅)，每孔分別加入350μL新鮮配制的ABTS染色混合液(655 mmol/L檸檬酸、345 mmol/L 檸檬酸鹽和 1%ABTS 溶液各 700 μL，70 μL 0.3%H2O2，雙蒸水定容至7 mL)［10］，反應20 min 后用雙蒸水洗滌2次，加入300 μL 2%NaF溶液，然后通過Olympus數(shù)碼顯微鏡觀察和拍照。

1.5 基盤過氧化物酶基因的分子克隆

1.5.1 大乳頭水螅總RNA的提取及mRNA的純化

取200條大乳頭水螅，停止喂食3 d后用 Trizol試劑提取總RNA。具體操作按試劑盒說明書進行。總RNA提取后，溶于無RNA酶的水中，-70℃冰箱備用。取50 μL總 RNA并按 Oligotex mRNA Purification Kit說明書純化mRNA。

1.5.2 SMART RACE cDNA文庫的構建

實驗操作基本按SMARTTM cDNA Library Construction Kit說明書進行。取3 μL mRNA樣品約0.5 μg，加到0.2 mL的反應管中，按說明書加入相應試劑及引物，反轉錄合成第一鏈cDNA;采用LD-PCR(longdistance PCR)技術合成第二鏈cDNA。

1.5.3 大乳頭水?；P特異性過氧化物酶全長cDNA序列的擴增及序列分析

根據水螅核基因組計劃由DNA數(shù)據推導的水?；P特異性過氧化物酶cDNA序列(GenBank序列號:NW_002092004)［11］設計了一對引物(HMPPOD-F:5'-tattcatttgtttaatataac-3';HMPPOD-R:5'-tgattagaatataaacttat-cac-3')，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以上述RACE cDNA文庫為模板，擴增水?；P特異性過氧化物酶基因全長cDNA序列。PCR總反應體積為50 μL，其中含10 × buffer 5 μL，25 mmol MgCl23.0 μL，2.5 mmol dNTP 2.0 μL，引物(10 μmol)各 1 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL(Takara，5 U/μL)，DNA 模板5 ～10 ng，使用滅菌后去離子水將反應總體積補至50 μL。反應體系95℃預變性5 min;95℃變性30 s，42℃復性30 s，68℃延伸90 s，循環(huán)次數(shù)為37;72℃延伸8 min。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測、成像。

PCR產物用柱式PCR產物純化試劑盒經切膠純化后用T/A Cloning Kit(TaKaRa)連接到克隆載體pMD 18-T vector中，再將重組質粒轉化大腸桿菌E.coli JM109感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆。單克隆菌株經擴大培養(yǎng)后，提取并純化質粒，采用通用引物M13和M13 Reserve在LI-COR DNA測序儀上進行雙向序列測定。

2 結果與分析

2.1 水?；P固著行為的動態(tài)觀察

為描述方便，把水?；P固著過程分為3個時期。

2.1.1 固著準備期

水螅身體舒展伸長，基盤端逐漸靠近載玻片玻璃表面，最終緊貼載玻片(圖1A-B)。

2.1.2 吸附面形成期

基盤與載玻片接觸的吸附面面積逐漸擴大(圖1C)，吸附面的粘液細胞分泌大量粘液，由于基盤吸附面緊貼載玻片，所以較多的粘液從基盤吸附面與載玻片間被擠壓出來(圖1D)。

2.1.3 “吸墊”形成期

吸附面形成后約20 min在顯微鏡下可以清晰觀察到僅僅吸附面的圓形周邊區(qū)域與固著物表面直接接觸、而吸附面中央區(qū)域不與固著物表面直接接觸，即基盤吸附面形成類似“吸墊”的結構(圖1E)。對固著時的基盤進行微波快速固定后的組織學研究結果直接證實了基盤吸附面中央區(qū)域與固著物表面不直接接觸、而是朝胃循環(huán)腔方向形成凹陷(圖1H)。另外，基盤吸附面形成類似“吸墊”結構后，吸附面的圓形周邊區(qū)域的外胚層細胞沿著載玻片表面形成許多片狀偽足和絲狀偽足(圖1F-G)。

2.2 水?；P粘液細胞分子標志物水螅基盤特異性過氧化物酶的表達模式

通過ABTS組織化學方法顯示水?；P粘液細胞分子標志物基盤特異性過氧化物酶僅在基盤吸附面的周邊區(qū)域外胚層細胞中表達(圖2)、而吸附面中央區(qū)域無表達，這個表達模式表明粘液細胞在基盤吸附面上不是均勻分布的，而僅分布在吸附面的周邊區(qū)域即吸附面與固著物直接接觸的部位。

圖2 大乳頭水?；P特異性過氧化物酶的表達模式Fig 2 The expression pattern of foot-specific peroxidase in Hydra magnipapillata

2.3 水?；P特異性過氧化物酶基因的克隆和序列分析

水?；P特異性過氧化物酶基因擴增產物大小和預期片段大小接近(圖3)，PCR產物測序后得到的cDNA序列已提交GenBank(GenBank登錄號:JF951860)，該序列中蛋白質編碼區(qū)共873 bp、編碼290個氨基酸(圖4)、其中第246核苷酸位點(C)與水螅核基因組計劃由DNA數(shù)據推導的水?；P特異性過氧化物酶cDNA序列相應位點(T)的堿基不同。在NCBI網站進行在線BLAST分析后發(fā)現(xiàn)該酶蛋白氨基酸序列中隱含2個類似fascin蛋白的結構域(圖5)，它們分別位于基盤特異性過氧化物酶氨基酸序列的38～154位點及117～244位點。

3 討論

從本研究的諸多結果綜合起來看，水?；P固著時基盤吸附面與固著物間的吸附力可能有以下3個來源。首先，吸附面的圓形周邊區(qū)域與固著物表面直接接觸、而吸附面中央區(qū)域不與固著物表面直接接觸(圖1E)，即基盤吸附面形成類似“吸墊”的結構應是基盤吸附力的主要來源。吸附面的圓形周邊區(qū)域與固著物表面緊貼、從而起著封固作用，使得吸附面中央區(qū)域與固著物表面之間形成的空隙與外界水體隔絕，這個空隙區(qū)域相當于是一個負壓區(qū)或低壓區(qū)、內部可能沒有水或有部分水。其次，基盤粘液細胞分泌的粘液在基盤吸附力的形成中演繹著重要角色，在基盤吸附面“吸墊”結構形成之前，粘液提供了基盤吸附面與固著物間初步的吸附力;在“吸墊”結構形成之后，吸附面的圓形周邊區(qū)域與固著物表面間的粘液起著封固劑的作用、以保持吸附面中央區(qū)域與固著物表面之間空隙中的負壓狀態(tài)。第三，吸附面圓形周邊區(qū)域外胚層細胞沿著載玻片表面形成的許多偽足增強了基盤吸附面的吸附力。

通過ABTS組織化學方法顯示水?；P粘液細胞分子標志物基盤特異性過氧化物酶僅在基盤吸附面的周邊區(qū)域外胚層細胞中表達(圖2)，而吸附面中央區(qū)域無表達，這個表達模式表明粘液細胞在基盤吸附面上不是均勻分布的，而僅分布在吸附面的周邊區(qū)域即吸附面與固著物直接接觸的部位，也說明基盤吸附面的周邊區(qū)域外胚層細胞是基盤粘液細胞。對基盤特異性過氧化物酶氨基酸序列進行生物信息學分析的結果表明，基盤特異性過氧化物酶氨基酸序列中包含fascin蛋白的2個保守結構域。fascin蛋白是一種小分子球狀蛋白，在細胞表面細胞膜突起的形成中起重要作用［12］。在一些小分子蛋白質因子如G-protein Rac等因素的激發(fā)下，細胞質中散亂的actin分子逐漸向細胞膜方向轉移，同時細胞膜向外突起形成偽足，在fascin蛋白的作用下有序交聯(lián)起來的actin分子聚合體就是偽足中的支撐物［13-15］。因此，水?；P特異性過氧化物酶可能具有的fascin蛋白活性有助于基盤粘液細胞偽足的形成、從而增強基盤對固著物的吸附力。

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