朱萬龍，姜文秀，王政昆

(云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650500)

哺乳動物的分布往往會受到環(huán)境變化、氣候波動等因素的影響，而這些影響往往表現(xiàn)為動物的遺傳變異［1］。分子標記作為種群遺傳結(jié)構(gòu)和地理變異的重要研究手段，被廣泛地應(yīng)用于遺傳變異問題的探討［2］。線粒體DNA是一種廣泛使用的分子標記，其特點是進化速度快、母系遺傳和非重組變異等［3］，而其包括的細胞色素b(Cyt b)基因適合于種群水平差異的檢測，普遍地用于動物的系統(tǒng)進化和分類研究［4］。

高山姬鼠(Apodemus chevrieri)屬于姬鼠屬，典型的古北界種類，主要分布于中國西南的橫斷山脈及其周圍地區(qū)［5］。中國的西南地區(qū)是古北界寒帶物種南遷，中南半島熱帶物種北移的交匯地，是生物多樣性研究的熱點地區(qū)之一;地處該區(qū)的云南省，西為橫斷山區(qū)，東為云貴高原，地勢西高東低、海拔變化劇烈、自然環(huán)境的地帶性和非地帶性變化明顯，這些可能導(dǎo)致豐富的物種多樣性，也可能存在生態(tài)物種的形成。棲息橫斷山和云貴高原的高山姬鼠，可能為了適應(yīng)不同的生存環(huán)境，出現(xiàn)種間水平的差異。因此，本研究利用細胞色素b基因?qū)υ颇?個地區(qū)高山姬鼠的遺傳變異進行研究，為高山姬鼠遺傳學(xué)研究提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

高山姬鼠捕自云南省中甸(3 305～3 296 m;N27°83'～26°84'，E99°68'～ 99°69')、麗江(2 556 ～ 2 590 m;N26°71'～26°96'，E100°20'～ 100°26')、劍川(2 556～2 590 m;N26°15'～ 26°45'，E99°40'～ 99°55')、昆明(2 125 ～ 2 139 m;N25°05 ～ 25°15'，E102°31' ～ 102°32')的農(nóng)田及灌木叢中，用冷凍保存(-70℃)的肝臟標本提取線粒體DNA。

1.2 DNA的提取

基因組DNA參照王文和施立明的堿變性法［6］進行提取。

1.3 PCR擴增

Cyt b 的 PCR 引物采用 P??bo 等［7］和 Irwin 等［8］報道的哺乳動物Cyt b通用引物，引物序列為L14724 5'-CGA AGCTTG ATA TGA AAA ACC ATC GTT G-3'，H15915 5'-CGG AAT TCC ATT TTT GGT TTA CAA GAC-3'，引物覆蓋長度為1 140 bp。

擴增體系為50 μL，其中含有10 μmol/L引物各1 μL、50 ng左右的 DNA 模板、10 × Buffer 5 μL、2 U Taq酶、25 mmol/L MgCl22 μL 和 10 mmol/L dNTPs 1 μL。擴增條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸1 min，30 個循環(huán);72℃延伸5 min;4℃終止反應(yīng)。實驗過程中使用空白對照來檢測PCR是否污染。

1.4 PCR產(chǎn)物純化和測序

擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用Glassmilk DNA純化回收試劑盒(博大泰克)進行割膠回收和純化，回收產(chǎn)物直接送大連寶生物工程有限公司測序。

1.5 序列分析

Cyt b序列使用ClustalX軟件［9］進行比對。利用MEGA4.0［10］軟件包分析序列特征、堿基組成、轉(zhuǎn)換與顛換值，計算遺傳距離;通過DnaSP 4.0［11］軟件計算單倍型多樣性(H)、單倍型的平均核苷酸差異數(shù)(K)和核苷酸多樣性(Pi);計算種群間的平均核苷酸差異數(shù)(Kxy)、遺傳分化指數(shù)(Fst)、核苷酸的分歧度(Dxy)、核苷酸凈遺傳距離(Da)和基因流(Nm)［12］。在MEGA 4.0軟件中，使用Kimura兩參數(shù)，以非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，系統(tǒng)樹各分支的自舉檢驗值由1 000次重復(fù)檢驗所得，使用黑線姬鼠(Gene Bank號:JL1105)的同源區(qū)序列作為外群。在ARLEQUIN3.10［13］軟件中進行Fst和種群間序列平均差異的分析以及分子變異分析 (AMOVA)，用Network 4.5軟件構(gòu)建進化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 DNA的PCR擴增

擴增結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測未發(fā)現(xiàn)非特異性條帶，空白對照組未出現(xiàn)擴增產(chǎn)物，沒有出現(xiàn)亮帶，表明未受外源DNA的污染(圖1)。

圖1 高山姬鼠mtDNA細胞色素b序列擴增結(jié)果Fig 1 The amplification on result of Cyt b gene sequence in A.chevrieri

2.2 Cyt b基因序列變異

本研究共獲得4個種群43只高山姬鼠的線粒體Cyt b基因全序列(1 140 bp)中共有50個核苷酸變異位點(占全部堿基數(shù)4.39%)，包含簡約信息位點21個，29個單變異位點，轉(zhuǎn)換和顛換(TS/TV)比為7.58，其A、T、G、C序列平均堿基組成為:30.8%、29.0%、12.8%和27.5%，其中A+T的比例顯著高于C+G。29個變異位點共定義22種單倍型，其中種群間的共享單倍型僅有1個(Hap3)，且均為3個橫斷山種群所共享。單倍型的分布信息見表1。

表1 高山姬鼠的單倍型分布Table 1 Haplotypes of the population of in A.chevrieri

2.3 遺傳多樣性和種群間遺傳差異

在4個種群中，昆明種群的Hd最高，麗江種群最低;昆明種群 Pi最高，劍川地區(qū)最低(表2)。Kxy、Dxy、Da均是昆明種群比橫斷山3個種群高。中甸、麗江、劍川3個種群間Nm＞1，表明群體間的基因流的水平較高，群體間遺傳分化較小;昆明種群與其它3個種群間Nm＜1，說明群體可能由于遺傳漂變而發(fā)生了分化(表3)。

表2 高山姬鼠Cyt b基因序列的變異位點及遺傳多樣性Table 2 Variable sites and genetic diversity based on Cyt b gene sequence in A.chevrieri

在4個種群中，除中甸和麗江種群間Fst不顯著外，其余各種群間的遺傳差異顯著;同時，種群序列平均差異除中甸和麗江種群差異不顯著外，其余各種群間的遺傳差異顯著(表4)。分子變異分析(AMOVA)表明，遺傳變異在種群內(nèi)為60.80%，而種群間為39.20%，種群內(nèi)變異大于種群間變異(表5)。

表3 高山姬鼠各種群遺傳分化及基因流Table 3 Genetic differentiation and Nm values among different populations in A.chevrieri

表4 高山姬鼠4個種群之間遺傳差異(Fst)及其顯著性(對角線下)和修正后的種群間序列平均差異(PiXY-(PiX+PiY)/2)及其顯著性(對角線上)Table 4 F-statistics test for pairwise population(below the diagonal)and P value of F-statistics test and corrected average pairwise difference(PiXY-(PiX+PiY)/2)(above the diagonal)between four populations in A.chevrieri

表5 高山姬鼠細胞色素b基因的分子變異分析Table 5 AMOVA of mitochondrial DNA Cyt b gene in A.chevrieri

2.4 單倍型系統(tǒng)發(fā)生分析

以黑線姬鼠為外群，22個單倍型在UP樹中明顯聚為兩支(A、B)，見圖2。其中來自橫斷山區(qū)(中甸、麗江、劍川)構(gòu)成一支(A)，其余個體聚為另外一支(B)，這一支除中甸、麗江、劍川種群外，還有來自昆明的種群。以Network構(gòu)建的單倍型進化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖顯示，除少部分單倍型是橫斷山和昆明混雜外，進化網(wǎng)絡(luò)總體分為兩大支，一支是橫斷山種群，一支是昆明種群(圖3)。

3 討論

遺傳多樣性的大小最直接的表達形式是遺傳變異的高低［14］，而遺傳多樣性的高低與物種的適應(yīng)能力等有關(guān)［15］。單倍型間的平均遺傳距離和核苷酸多態(tài)性是遺傳變異重要的衡量指標［16］，國內(nèi)外已有很多研究［17-19］。本研究結(jié)果表明在4個種群中，昆明種群單倍型多樣性和核苷酸多樣性最高。此外，60.8%的變異在種群內(nèi)部，39.2%的變異存在于種群之間，遺傳變異在種群間和種群內(nèi)部均有發(fā)生，種群內(nèi)的遺傳變異較種群間的大，并且發(fā)生在種群內(nèi)的遺傳變異較發(fā)生在種群間的遺傳大。由此可以推斷出，云南4個地區(qū)的高山姬鼠種群的演變和發(fā)展過程已經(jīng)出現(xiàn)了一定程度的遺傳變異。

地理環(huán)境和生活習(xí)性的不同會引起種群的分化，進而導(dǎo)致種群間出現(xiàn)遺傳分化，衡量遺傳分化的指標有基因分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)等。Fst表示不同種群之間遺傳差異的程度［20］，Nm則表示不同種群之間由個體的遷移所產(chǎn)生的基因流動［21，22］。距離隔離理論［23］認為遺傳分化的程度會隨著地理距離的增加而增加［24］。本研究Fst結(jié)果表明高山姬鼠的4個地理種群之間的遺傳差異除中甸和麗江種群之間不顯著外，其它地理種群之間的差異都極顯著，表明種群之間有較高的遺傳分化。昆明種群與其他3個種群間的基因流值相對較小，表明昆明與其他種群間的基因交流沒有其他種群之間基因交流頻繁，說明昆明與其它種群之間可能存在地理阻隔。從這4個種群的地理位置來看，昆明種群與其余3個種群之間的地理距離最遠，中甸、劍川、麗江之間地理距離較近。因此可以初步推測，地理距離可能是影響高山姬鼠各種群間遺傳分化的一個重要因素。以上所有結(jié)果表明高山姬鼠在滇中昆明地區(qū)的遺傳多樣性顯著高于橫斷山區(qū)，并在橫斷山種群和滇中種群間已出現(xiàn)基因流明顯減小的現(xiàn)象，推測橫斷山種群和昆明種群已有了較明顯的種群遺傳分化，盡管分化尚未完全形成。

大約200萬年前，高山姬鼠的近緣種黑線姬鼠由歐洲擴散到亞洲，進而擴張至整個古北界，并分化出高山姬鼠［25］;橫斷山區(qū)核心地帶形成時間距今約2300萬年至6500萬年前的古近紀，云貴高原形成時間是距今約3600萬年至5300萬年前的第三紀始新世時期［26］，這表明在橫斷山形成之后，高山姬鼠的祖先種才從歐洲或者是亞洲北部擴張進入橫斷山，推測種群擴散方向可能從橫斷山地區(qū)到昆明地區(qū)。22個單倍型在系統(tǒng)發(fā)生樹中明顯聚為兩支(橫斷山種群和滇中昆明種群)，進化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系表明昆明種群處于進化分支最末端，推測種群進化方向可能從橫斷山地區(qū)到昆明地區(qū)，支持了姬鼠屬從北向南擴散的理論。此外，經(jīng)單倍型系統(tǒng)樹和Network網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析表明橫斷山種群和滇中昆明種群間已經(jīng)出現(xiàn)了遺傳分化，盡管還有部分單倍型混雜、分化不完全。

綜上所述，本研究顯示4個地區(qū)的高山姬鼠已經(jīng)出現(xiàn)一定的遺傳變異，推測高山姬鼠種群進化方向可能從橫斷山地區(qū)到昆明地區(qū)，支持了姬鼠屬從北向南擴散的理論。

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