盛 磊，郝樹芳，周潔蕓，楊 英，周嫻穎，郭湘潔，李 釗，謝淑武，朱 焰

(1.復(fù)旦大學(xué)，上海 200032;2.上海市計劃生育科學(xué)研究所生殖藥理組，國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室，上海生殖健康藥具工程技術(shù)研究中心，上海 200032;3.山西省兒童醫(yī)院婦幼保健院，山西太原 030002;4.寧夏銀川市第一人民醫(yī)院，寧夏銀川 750001)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMs)雖然是一種良性婦科疾病，但具有惡性腫瘤種植、生長、浸潤等特點。育齡期女性子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病率高達10～15%［1］。EMs的治療原則是根據(jù)患者年齡、癥狀、病變部位、病情嚴重程度和范圍以及患者對生育的要求情況等因素采用藥物治療、手術(shù)治療或手術(shù)聯(lián)合藥物治療等方法［2］。人參皂苷是人參中最主要的活性成分。研究顯示人參皂苷Rh2可抑制癌細胞向其它器官轉(zhuǎn)移，并通過調(diào)控腫瘤細胞增殖周期、誘導(dǎo)細胞分化和凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。因此，我們應(yīng)用實驗性EMs大鼠模型，觀察人參皂苷Rh2對實驗性大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用，并研究了人參皂苷Rh2對血清E2、P和EMAb水平的影響，以及異位內(nèi)膜中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 ♀成熟未孕清潔級SD(Sprague Dawley)大鼠60只，實驗前體重為200 g～250 g，由上海西普爾-必凱公司提供，合格證號:SCXK(滬)2008－0016。

1.1.2 藥品和試劑 人參皂苷Rh2:HPLC＞99%，購自上海順博生物工程有限公司，批號:20100811。Elisa試劑盒(雌激素E2、孕激素P、抗子宮內(nèi)膜抗體EMAb)購自美國ADL生物科技公司;蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Bax、Bcl-2、β-actin購自美國Santa Cruz公司;Caspase-9、Caspase-3、HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購自abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 參照文獻［4］選取動情周期規(guī)則的SD大鼠35只進行造模，其中造模成功的大鼠共30只。手術(shù)在無菌環(huán)境中進行，以3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠1 ml·kg－1。將大鼠仰臥四肢固定于手術(shù)臺上，腹部消毒后做2～3 cm切口，游離右側(cè)子宮，剪取靠近卵巢處約1.5 cm一段子宮置入含生理鹽水的培養(yǎng)皿中，肌層與子宮內(nèi)膜層分離后，將內(nèi)膜剪成5 mm×5 mm大小與腹壁肌肉縫合固定，常規(guī)關(guān)腹。

1.2.2 模型的判定 模型建立21 d后，第2次開腹，用電子游標(biāo)卡尺測量移植物的長mm、寬mm、高mm，按照V=D1×D2×D3計算異位內(nèi)膜體積(D1，D2，D3分別是異位內(nèi)膜長，寬，高)，記錄觀察移植物的生長情況，存活與否。EMs模型建模成功觀察標(biāo)準［5］:移植灶體積增大(體積大于25 mm3;高度大于1 mm)，呈透明的結(jié)節(jié)狀、囊狀、有澄清液體積聚，移植物被結(jié)締組織覆蓋并有血管形成，質(zhì)地軟。

1.2.3 分組給藥及解剖取材 造模成功的大鼠共30只，每組6只，按模型異位內(nèi)膜大小隨機分為5組:模型對照組給予溶劑0.5%羧甲基纖維素鈉(0.5%CMC-Na 1.5 ml·kg－1·d－1)、陽性對照組給予孕三烯酮(1.5 mg·kg－1·d－1)、Rh2 低、中、高組分別給予 Rh2(5、10、40 mg·kg－1·d－1)，分別相當(dāng)于人(60 kg)用劑量 50、100、400 mg·d－1。Rh2混溶于0.5%CMC-Na中配成混懸液。連續(xù)灌胃21 d，在末次給藥24 h內(nèi)麻醉解剖大鼠，經(jīng)腹主動脈取血，測量異位內(nèi)膜大小，立即取出異位內(nèi)膜組織，于4%多聚甲醛和液氮保存。異位內(nèi)膜抑制率按如下公式計算:抑制率/%=(V給藥前－ V給藥后)/V給藥前×100%，V為異位內(nèi)膜體積。

1.2.4 HE染色 將置于4%多聚甲醛中固定的正常子宮和異位內(nèi)膜進行常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察正常子宮及異位內(nèi)膜組織病理形態(tài)學(xué)特點。

1.2.5 ELISA 檢測 血清中 E2、P和 EMAb水平測定方法按照說明書操作步驟進行，所有樣本均設(shè)置復(fù)孔檢驗以減少誤差。最后在450 nm波長處讀取吸光度值，做出標(biāo)準曲線讀出各指標(biāo)的濃度。

1.2.6 Western blot分析 異位內(nèi)膜組織加蛋白裂解液冰上勻漿，12 000×g離心15 min后取上清液，BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。每組每份樣本取100 μg進行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠80 V，15 min;分離膠110 V，1 h)，轉(zhuǎn)膜(110 V，1.5 h)，Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、Caspase-9(1∶1 000)和 Caspase-3(1∶1 000)4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯色液顯影，暗室曝光掃描灰度值。各目的條帶與β-actin條帶灰度值比值作為該目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 Rh2對在位子宮內(nèi)膜及異位內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，模型對照組的異位內(nèi)膜體積明顯增大(Fig 1A～B)，而Rh2高劑量組(40 mg·kg－1)明顯抑制異位內(nèi)膜生長，異位內(nèi)膜明顯縮小(Fig 1C～D)。

模型對照組大鼠與Rh2各劑量組大鼠在位子宮無明顯差異。均可見子宮平滑肌層較薄，平滑肌細胞細長，內(nèi)環(huán)外縱，規(guī)則排列。內(nèi)膜腺體形態(tài)規(guī)則，呈圓形或橢圓形，數(shù)量多，腺腔小，腺體上皮細胞均為單層立方或柱狀，核下可見空泡和頂漿分泌(Fig 2A)。與在位內(nèi)膜相比，手術(shù)移植的異位內(nèi)膜生長良好，在鏡下可見生成一個腔樣結(jié)構(gòu)，囊內(nèi)有豐富的分泌物(Fig 2B)，提示異位內(nèi)膜模型建立成功。給藥21 d后，與模型對照組相比，Rh2各劑量組大鼠異位內(nèi)膜生長受到不同程度抑制，并可觀察到異位內(nèi)膜組織萎縮，間質(zhì)疏松，腺體數(shù)目減少，腺腔明顯萎縮，腔內(nèi)積液體積縮小(Fig 2D～F)。

Fig 1 Effect of Rh2 on gross morphology of ectopic endometrium in the rat model of endometriosis

2.2 Rh2對SD大鼠異位內(nèi)膜生長的抑制作用在連續(xù)給予21 d 0.5%CMC-Na、孕三烯酮和Rh2后，模型對照組異位內(nèi)膜體積明顯增大，而孕三烯酮組和Rh2低、中、高劑量組在給予不同劑量后異位內(nèi)膜生長受到抑制，異位內(nèi)膜體積明顯減小。Rh2(5、10、40 mg·kg－1)對異位內(nèi)膜生長的抑制率呈劑量依賴性地增加。與模型對照組相比，孕三烯酮(1.5 mg·kg－1)和 Rh2(5、10、40 mg·kg－1)能明顯抑制異位內(nèi)膜生長(P＜0.05)(Tab 1)。

2.3 Rh2對血清中E2，P，EMAb水平的影響結(jié)果顯示，連續(xù)給予 Rh2(5、10、40 mg·kg－1)21 d后，大鼠血清中E2、P和EMAb水平呈劑量依賴性地降低。與模型對照組相比，Rh2(40 mg·kg－1)血清中E2、P和 EMAb水平明顯降低(P＜0.05)(Tab 2)。

Fig 2 Effect of Rh2 on histopathological change of ectopic endometrium in the rat model of endometriosis

Tab 1 Inhibitory effect of Rh2 on the growth of ectopic endometrium in the model rat of endometriosis(±s，n=6)

Tab 1 Inhibitory effect of Rh2 on the growth of ectopic endometrium in the model rat of endometriosis(±s，n=6)

*P＜0.05 vs model control

Group Dose/mg·kg－1inhibition/%Model Control － －67±70 Gestrinone 1.5 59 ±19*Rh2 low 5 46±25*Rh2 medium 10 45±22*Rh2 high 40 81±11*

Tab 2 Effect of Rh2 on the serum level of E2，P and EMAb in the rat model of endometriosis( ± s，n=6)

Tab 2 Effect of Rh2 on the serum level of E2，P and EMAb in the rat model of endometriosis( ± s，n=6)

*P＜0.05 compared with model control

Group Dose/mg·kg－1 E2/ng·L －1 P/ng·L－1 EMAb/ng·L －1 Model Control － 78±16 44±2 4 143±64 Gestrinone 1.5 46±15 29±12* 3 938±840 Rh2 low 5 57±18 30±5 3 865±101 Rh2 medium 10 54±30 25±5* 3 799±39*Rh2 high 40 44±11* 25±4* 3 606±112*

2.4 Rh2對 Bcl-2、Bax表達的影響 Western blot結(jié)果顯示，Bax隨Rh2劑量增大表達增加，而Bcl-2隨Rh2劑量增大表達減少。與模型對照組相比，Rh2高劑量組(40 mg·kg－1)Bax蛋白的表達差異有顯著性(P＜0.05)，Bax/Bcl-2的比例明顯增加(P＜0.05)(Fig 3)。

2.5 Rh2對Caspase-3 and Caspase-9表達的影響Western blot結(jié)果顯示，在模型對照組中，Caspase-3、剪切后Caspase-3和Caspase-9蛋白表達較少;而在孕三烯酮對照組和 Rh2(5、10、40 mg·kg－1)組中，Caspase-3、剪切后Caspase-3和Caspase-9蛋白表達增加，且與Rh2劑量效應(yīng)呈正相關(guān)。與模型對照組相比，在Rh2高劑量組(40 mg·kg－1)中Caspase-3、剪切后Caspase-3和Caspase-9表達明顯升高(P＜0.05)(Fig 4)。

3 討論

人參是我國名貴的中藥材，其中人參皂苷是人參主要的生物活性物質(zhì)。到目前為止，已分離鑒定40余種單體，人參皂苷單體化合物中Rg1、Rb1、Re、Rb2等含量較高，往往作為主要人參皂苷進行研究。而Rh2、Rd、Rg3和Compound K等稀有皂苷，藥理活性則優(yōu)于主要人參皂苷，與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用，現(xiàn)在也逐漸成為研究的熱點［6］。人參皂苷Rh2具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎等各種生物活性，尤其抗腫瘤活性更為國內(nèi)外學(xué)者所重視［7］。本文首次觀察了人參皂苷Rh2對實驗性大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的抑制作用，目的在于探索將天然產(chǎn)物單體用于治療子宮內(nèi)膜異位癥的可能性。我們的研究結(jié)果顯示，給予人參皂苷 Rh2(5、10、40 mg·kg－1)后，異位內(nèi)膜生長減緩，體積減小，隨著Rh2劑量增加，對異位內(nèi)膜生長的抑制率呈劑量依賴性地增加;而給予溶劑0.5%CMC-Na的模型對照組中，異位內(nèi)膜生長迅速，體積增大，不能抑制異位內(nèi)膜生長，提示人參皂苷Rh2可用于治療子宮內(nèi)膜異位癥。

Fig 3 Effect of Rh2 on the expression of Bcl-2，Bax of ectopic endometrium in the rat model of endometriosis(n=6)

子宮內(nèi)膜異位癥是一種激素依賴性疾病，降低激素的水平可用來治療該疾病。EMAb是一種自身抗體，當(dāng)子宮內(nèi)膜有炎癥發(fā)生時EMAb的水平會明顯升高，造成子宮內(nèi)膜功能異常，甚至導(dǎo)致不孕或流產(chǎn)。EMAb的產(chǎn)生，一方面是因異位子宮內(nèi)膜刺激免疫系統(tǒng)，另一方面是機體的免疫系統(tǒng)失常的原因［8］。本實驗通過Elisa方法測定Rh2作用后的大鼠血清E2、EMAb和P水平，發(fā)現(xiàn)血清中E2、EMAb和P水平隨著Rh2劑量的加大而降低，其中Rh2(40 mg·kg－1)明顯降低 E2、EMAb和 P 水平，表明Rh2抑制異位內(nèi)膜的生長與E2、EMAb和P水平降低有關(guān)。

Fig 4 Effect of Rh2 on the expression of Caspase-9，Caspase-3 and cleaved Caspase-3 of ectopic endometrium in the rat model of endometriosis(n=6)

Bcl-2基因是一種原癌基因，具有抑制凋亡的作用。Bax基因?qū)儆贐cl-2基因家族，其編碼的Bax可與Bcl-2形成異二聚體，對 Bcl-2產(chǎn)生阻抑作用［9－10］。本實驗結(jié)果表明，Rh2(5、10 和 40 mg·kg－1)可增加 Bax表達，降低 Bcl-2表達，其中 Rh2(40 mg·kg－1)明顯增加Bax的表達，升高Bax/Bcl-2比例(P＜0.05)，該結(jié)果提示Rh2可以通過增加Bax/Bcl-2的表達，發(fā)揮抑制異位內(nèi)膜生長的作用。該結(jié)果和Bilotas等［11］發(fā)現(xiàn)GnRHa通過增加Bax表達，降低Bcl-2表達，誘導(dǎo)子宮異位內(nèi)膜細胞的凋亡，而達到治療疾病的結(jié)果相似。

然而凋亡發(fā)生是一個復(fù)雜的、由Caspase家族介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程，即凋亡信號首先活化啟動型 Caspase(如 Caspase-2，8，9)，再介導(dǎo)水解效應(yīng)型 Caspase酶原，使效應(yīng)型 Caspase活化(如Caspase-3，6，7)，然后作用于底物，使蛋白分解引起細胞凋亡［12］。本實驗結(jié)果顯示，Rh2(40 mg·kg－1)能明顯提高異位內(nèi)膜細胞的 Caspase-3和Caspase-9的表達，提示了Rh2可通過Caspase家族介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)子宮異位內(nèi)膜細胞的凋亡。

綜上所述，本文首次發(fā)現(xiàn)了Rh2(40 mg·kg－1)可明顯抑制大鼠子宮異位內(nèi)膜的生長，其作用機制可能與降低 E2、P、EMAb水平、上調(diào) Bax/Bcl-2表達、激活細胞凋亡的內(nèi)源性途徑啟動因子Caspase-9蛋白、激活執(zhí)行因子Caspase-3蛋白表達和誘導(dǎo)子宮異位內(nèi)膜細胞的凋亡有關(guān)。該結(jié)果表明天然產(chǎn)物單體人參皂苷Rh2可用于治療子宮內(nèi)膜異位癥。

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