黃邵洪，胡昆鵬，葉 升，嚴(yán)淑紅

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1.胸心外科、2.肝膽外科，廣東 廣 州 510080;3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，廣東廣州 510088;4.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院影像檢驗(yàn)中心廣東廣州 510655

食管癌是威脅人類健康的十大惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全部惡性腫瘤的1% ～2%，死亡率位居世界癌癥死因的第6位［1－2］。中國(guó)是世界上食管癌的發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家，發(fā)病和死亡人數(shù)分別占全球的53.86%和49.26%［3］。隨著診療技術(shù)的不斷改進(jìn)和提高，早期食管癌患者的5年生存率不斷提高，但總體死亡率仍舊居高不下［4］。由于多數(shù)食管癌患者確診時(shí)己為中晚期，因此早期診斷對(duì)提高療效和改善預(yù)后起關(guān)鍵作用。研究導(dǎo)致食管癌發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素，尋求預(yù)防和控制食管癌發(fā)生與發(fā)展的對(duì)策是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

Kruppel樣因子 4(Kruppel like factor 4，KLF4)又稱為胃腸富集Kruppel樣因子(Gut enriched Kruppel like factor，GKLF)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)鋅指轉(zhuǎn)錄因子。KLF4是Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡細(xì)胞和分化。接觸抑制、血清饑餓和DNA損傷均可刺激KLF4，使其表達(dá)增加［5－6］。KLF4在惡性腫瘤中的作用研究結(jié)果不一致，最初的研究認(rèn)為KLF4是一個(gè)癌基因。在乳腺導(dǎo)管癌中，KLF4的表達(dá)升高，并且與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后呈正相關(guān)［7］。在基底角質(zhì)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KLF4，則可導(dǎo)致細(xì)胞的增生和發(fā)育異常，并最后形成鱗狀細(xì)胞癌［8］。但是，另外一些研究則表明KLF4在某些腫瘤中的表現(xiàn)呈現(xiàn)出抑癌基因的特性［5－6］。目前其在食管癌中的作用國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究檢測(cè)了食管癌細(xì)胞株KYSE140、KYSE150、EC109 及 EC9706、食管永生化細(xì)胞NE3中KLF4的表達(dá)，及其對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、侵襲、成瘤功能的影響，以探討其在食管癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人食管癌細(xì)胞系KYSE140、KYSE150、EC109、EC9706及食管永生化細(xì)胞NE3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)(上海)。

1.2 試劑 M199、RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，胰蛋白酶(Gubco公司)，KLF4的特異性siRNA和非特異性siRNA(control siRNA)(Santa Cruz公司)，兔抗人KLF4多克隆抗體(Santa Cruz公司)，Western blot用兔抗人多克隆抗β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，羊抗兔和兔抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，脂質(zhì)體Lipofectamine2000(Invitrogen公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) KYSE140、KYSE150細(xì)胞在恒溫37℃、飽和濕度、含5%CO2的條件下，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)，EC109及EC9706細(xì)胞在恒溫37℃、飽和濕度、含5%CO2的條件下，在含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)。食管永生化細(xì)胞NE3在恒溫37℃、飽和濕度、含5%CO2的條件下，在不含胎牛血清的K-SFM培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)，用含0.25%trypsin和0.02%EDTA的消化液進(jìn)行消化傳代。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 Western blot法檢測(cè)KLF4在不同食管癌細(xì)胞株中的蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE140、KYSE150、EC109、EC9706及 NE3細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，4℃條件下靜置 1 h。4℃，12 000 r·min－1，離心30 min后，提取的上清液即為總蛋白。取50 μg蛋白常規(guī)12%SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜(Mini-PROTEAN 3 System，Bio-Rad)。脫脂奶粉封閉后與抗KLF4(1∶400)和抗B-actin(1∶500)結(jié)合，4℃過(guò)夜，復(fù)溫后與二抗室溫下進(jìn)行結(jié)合，反應(yīng)時(shí)間為2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，壓片，顯影，定影，通過(guò)自動(dòng)電泳凝膠圖像處理系統(tǒng)(Kodak EDAS290)進(jìn)行掃描分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 KLF4-siRNA 按照脂質(zhì)體Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)的步驟，將KLF4-siRNA1、KLF4-siRNA2及control siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至KLF4陽(yáng)性表達(dá)的人食管癌細(xì)胞KYSE140中。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 將KYSE140-KLF4-siRNA1、KYSE140-KLF4-siRNA2、KYSE140-control siRNA細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)5個(gè)平行孔，在恒溫37℃、飽和濕度、含5%CO2的條件下培養(yǎng)，分別于第1～7天加入 100 μl終濃度為 5 g·L－1甲基噻唑基四唑(MTT)工作液，培養(yǎng)4 h后除去上清，每孔加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液溶解MTT還原物，震蕩15 min使結(jié)晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。以時(shí)間作為橫坐標(biāo)，A490值作為縱坐標(biāo)，評(píng)估細(xì)胞的增殖情況。

1.7 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化后，制成細(xì)胞懸液備用，0.7% 瓊脂與2×RPMI-1640培養(yǎng)液按1∶1比例混合，加入細(xì)胞懸液，充分混勻，制成密度為1×106·L－1的混懸液，每孔1 000 μl注入到含0.6%下層瓊脂的6孔板中，待瓊脂凝固后，置于恒溫37℃、飽和濕度、含5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2周。用0.2% 的p-iodonitrotetrazolium violet染色，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞集落形成并拍照。

1.8 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 在Transwell小室的上室面加入50 μl按1∶3的比例混合的Matrigel與無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃凝固、風(fēng)干。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，加入含5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，配置成密度為3×108·L－1的細(xì)胞懸液，每孔上室加入100 μl細(xì)胞懸液，下室加入RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%FBS)。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽擦去Matrigel膠和上室內(nèi)細(xì)胞。用95%甲醇固定20 min，室溫風(fēng)干，用0.25%結(jié)晶紫染色，PBS沖洗掉背景顏色。室溫風(fēng)干后，置于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)比較組間差別。

2 結(jié)果

2.1 KLF4在不同人食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)KLF4在KYSE140細(xì)胞中蛋白表達(dá)量明顯高于KYSE150、EC109及 EC9706(Fig 1)。故選取KYSE140細(xì)胞進(jìn)行KLF4-siRNA干擾。

Fig 1 Expression of KLF4 in the immortalized cell and esophageal cancer cell lines

2.2 轉(zhuǎn)染 KLF4-siRNA的 KYSE140細(xì)胞系中KLF4的表達(dá) 在人食管癌細(xì)胞系KYSE140轉(zhuǎn)染KLF4-siRNA1、KLF4-siRNA2后，KLF4蛋白表達(dá)明顯減少，而轉(zhuǎn)染control siRNA的細(xì)胞中KLF4表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(Fig 2)。

2.3 KLF4抑制食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng) 通過(guò)MTT法繪制各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線以研究KLF4的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。與對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染KLF4-siRNA1、KLF4-siRNA2的KYSE140細(xì)胞其生長(zhǎng)速度明顯上升(Fig 3)。

2.4 KLF4對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲能力的影響 通過(guò)計(jì)算向培養(yǎng)液移動(dòng)并穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)量來(lái)衡量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的侵襲能力。與轉(zhuǎn)染control siRNA的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染 KLF4-siRNA1、KLF4-siRNA2的KYSE140細(xì)胞穿過(guò)transwell微孔膜的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞的侵襲能力明顯提高(Fig 4)。

Fig 2 KLF4-siRNA1 and KLF4-siRNA2 transfection decreased KLF4 expression in KYSE140 cells

Fig 3 Impact of KLF4 on KYSE140 cell's proliferation capacity

2.5 KLF4對(duì)食管癌細(xì)胞成瘤能力的影響 軟瓊脂集落形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染control siRNA的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染 KLF4-siRNA1、KLF4-siRNA2的KYSE140細(xì)胞形成的集落明顯增加。

Fig 4 Impact of KLF4 on KYSE140 cell's invasion capacity

3 討論

人類KLF4基因定位于染色體9q31，是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)KLF家族轉(zhuǎn)錄因子，編碼一個(gè)由470個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)［9］。KLF4參與調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的很多重要過(guò)程，如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡細(xì)胞和分化。接觸抑制、血清饑餓和DNA損傷均可刺激 KLF4，使其表達(dá)增加［5－6］，與此研究結(jié)果一致，KLF4在某些腫瘤中表達(dá)下調(diào)，如食管癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、等［10-13］。在這些腫瘤中，KLF4表現(xiàn)出抑癌基因的特性。然而，最初研究認(rèn)為KLF是一個(gè)癌基因，KLF4在乳腺癌和舌癌中均呈高表達(dá)［14－15］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，KLF4在某些腫瘤細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞的侵襲及遷移能力起到負(fù)性調(diào)節(jié)的作用［5－6］。

在乳腺永生化細(xì)胞株MCF-1OA中敲降KLF4，可引起上皮細(xì)胞形態(tài)的改變，并且細(xì)胞的遷移能力增加，在高轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231中，KLF4可以結(jié)合E-cadherin上游的啟動(dòng)子區(qū)域GC-rich/E-box位點(diǎn)，進(jìn)而上調(diào)E-cadherin表達(dá)。過(guò)表達(dá)KLF4后，MDA-MB-231細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)增加，而該細(xì)胞的侵襲、遷移能力均有明顯下降［16］。RKO是低分化的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，在RKO細(xì)胞過(guò)表達(dá)KLF4后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞多被阻滯于G1/S期［17］。通過(guò)誘導(dǎo)KLF4的穩(wěn)定表達(dá)，RKO細(xì)胞的侵襲和遷移能力可受到抑制［18］。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將過(guò)表達(dá)KLF4的胰腺癌細(xì)胞注射入小鼠體內(nèi)，胰腺癌的轉(zhuǎn)移能力可受到抑制［12］。KLF4在肺癌細(xì)胞系中可以通過(guò)抑制SPARC的表達(dá)而使細(xì)胞的侵襲能力受到抑制［19］。邏輯回歸分析顯示，在前列腺腫瘤中，KLF4低表達(dá)則發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)可提高15倍［20］。由此可見(jiàn)，KLF4對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力起到負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。

本研究采用Western blot方法對(duì)食管癌及食管永生化細(xì)胞中KLF4蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并分析其表達(dá)缺失對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、侵襲、錨定非依賴性生長(zhǎng)及成瘤能力的影響，基因敲降研究表明，KLF4表達(dá)降低后，人食管癌細(xì)胞KYSE140的增殖能力明顯提高，同時(shí)，錨定非依賴性生長(zhǎng)和穿膜能力均有大幅度提高。以上研究結(jié)果表明，在食管粘膜上皮癌變過(guò)程中，KLF4發(fā)揮著舉足輕重的作用，KLF4的表達(dá)可阻止食管癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。

綜上所述，KLF4的表達(dá)缺失可能是食管癌變過(guò)程中的早期事件，與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。可能成為食管癌治療的潛在靶標(biāo)。刺激KLF4在食管癌組織中的表達(dá)可能成為控制食管癌發(fā)生、發(fā)展的新途徑。隨著對(duì)KLF4功能研究的完善，其必將成為診斷和預(yù)測(cè)的食管癌的分子標(biāo)志物和抗食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的生物治療靶點(diǎn)。

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