石鐵鋒，楊春曉，楊東曉，閆彬彬，許 艷，張 輝，張 穎，徐滿英

(哈爾濱醫(yī)科大學1.附屬第二醫(yī)院、2.生理學教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

阿片類藥物依賴已成當今世界的重要社會問題之一，不僅危害人類的身心健康和家庭幸福，而且還嚴重地干擾了社會安寧和生產(chǎn)發(fā)展。嗎啡依賴是一種頑固的、慢性復發(fā)性腦?。?］，是多個腦區(qū)、多種神經(jīng)遞質參與的復雜的一系列神經(jīng)系統(tǒng)適應性改變。動物在嗎啡依賴過程中，腦內(nèi)腎上腺素能等神經(jīng)遞質系統(tǒng)發(fā)生一定變化，這些變化可能與嗎啡成癮的產(chǎn)生有密切關系。

在大鼠腦內(nèi)，去甲腎上腺素(NE)是一種重要的神經(jīng)遞質。NE參與許多腦功能，包括覺醒、注意力、情緒、學習、記憶和應激反應［2］。NE對疼痛的影響是復雜的。NE對疼痛的作用取決于其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特異位點，NE能受體亞型的分布，病理性疼痛狀態(tài)的持續(xù)時間和當時的情況。NE和其他化學物質在下行抑制系統(tǒng)發(fā)揮重要的作用。NE可抑制C纖維傳導周圍傷害性刺激信息到脊髓側角［3］。

伏核(NAc)是位于邊緣系統(tǒng)和基底神經(jīng)節(jié)交界處的一個較大的核團。NAc接受大腦不同區(qū)域的各種神經(jīng)纖維的投射，參與調節(jié)機體的多種功能，如藥物成癮、行為、學習、運動和心血管活動等。NAc還含有豐富的內(nèi)源性阿片肽，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛傳送和調制中起著重要作用。NAc內(nèi)的阿片肽和膽囊收縮素相互作用可以調節(jié)疼痛。來自中腦導水管周圍灰質(PAG)神經(jīng)纖維上行投射到NAc和NAc神經(jīng)纖維下行投射到PAG，它們均參與鎮(zhèn)痛作用。我們研究室已證明［4］，谷氨酸、地卓西平馬來酸鹽和N-甲基-D-天冬氨酸受體參與NAc內(nèi)傷害性信息傳送的調制。近年來，多項研究已經(jīng)證實在NAc內(nèi)存在NE，并表明它在疼痛調節(jié)中起著重要作用［5］。但是，NE和酚妥拉明對嗎啡依賴大鼠NAc內(nèi)PENs和PINs的痛誘發(fā)電活動的影響尚不清楚。因此，本研究使用細胞外的電生理記錄技術，探討NE和酚妥拉明對嗎啡依賴大鼠NAc內(nèi)PENs和PINs的痛誘發(fā)電活動的影響，以便揭示NE和NAc在嗎啡依賴大鼠中樞痛覺生產(chǎn)和調制的作用。

1 材料和方法

1.1 動物 實驗選用成年、健康Wistar大鼠，清潔級，♀♂不拘，體質量為220～250 g(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院動物中心提供，級別:Ⅱ，許可證號:黑20020002)。

1.2 方法 大鼠在注射鹽酸嗎啡前，記錄30 min的行為變化。然后，大鼠按逐日遞增劑量的原則，背部皮下注射鹽酸嗎啡，連續(xù)給藥6 d，每日藥量依次為:5、10、20、40、50、60 mg·kg－1，3 次 .d－1(8 ∶00，12 ∶00，16 ∶00)，建立嗎啡成癮大鼠的模型［6－7］。

將60只嗎啡依賴大鼠隨機地分為3組:(1)生理鹽水組(20只):NAc內(nèi)注射生理鹽水0.5 μl;(2)NE 組(20 只):NAc內(nèi)注射 NE(4 g·L－1，0.5 μl);(3)酚妥拉明組(20只):NAc內(nèi)注射酚妥拉明(4 g·L－1，0.5 μl);給每種藥的時間均為2 min。d 7 早8∶00觀察大鼠的自然戒斷癥狀后，開始實驗。嗎啡依賴大鼠用200 g·L－1氨基甲酸乙酯(5 ml·kg－1，北京化工廠)腹腔注射麻醉和 50 g·L－1利多卡因必要時創(chuàng)口補充麻醉下實施常規(guī)手術，即氣管插管、顱骨開窗、挑開小腦延髓池處的硬腦膜引流腦脊液和分離坐骨神經(jīng)。術后，將大鼠頭部固定在SN-2腦立體定位儀(Narishige，Japan)上。大鼠腹腔注射溫生理鹽水5 ml補液，熱水袋保暖，維持肛溫37℃ ～38℃。根據(jù) Pellegrino圖譜 B座標系統(tǒng)［8］，對NAc進行定位:A:3.2～4.0 mm;R 或 L:1.0～1.8 mm;H:6.2～7.0 mm。然后進行人工呼吸，并大鼠腹腔注射1 g·L－1氯化筒箭毒堿 (1 ml·kg－1)制動，以松弛肌肉排除肌細胞電活動對本實驗的影響。將帶保護的兩根銀絲刺激電極平行鉤在坐骨神經(jīng)上，松緊適宜，用液體石蠟浸沒神經(jīng)。SEN-3301型電子刺激器(Nihon Konden，Japan)發(fā)出的串脈沖(延遲:0 ms，間隔:5 ms，強度:5 mA，持續(xù)時間:0.3 ms，脈沖:5個)刺激大鼠坐骨神經(jīng)，作為傷害性痛刺激。關節(jié)運動和毛發(fā)觸摸被用作非傷害性刺激，以確定疼痛相關的神經(jīng)元。將內(nèi)充3 mol·L－1氯化鉀溶液，直流電阻為10～30 MΩ的玻璃微電極固定在SM-21型微電極操縱器(Narishige，Japan)上，并插入NAc內(nèi)引導痛反應神經(jīng)元的放電。根據(jù)Pellegrino圖譜B座標系統(tǒng)［8］，將內(nèi)充生理鹽水或NE、酚妥拉明的玻璃微電極固定在SM-11型微電極操縱器(Narishige，Japan)上，并插入NAc(A:3.6 mm;R或L:1.6 mm;H:6.2 mm)內(nèi)，然后用ZCZ-50型自動抽注儀分別向NAc內(nèi)勻速注入0.5 μl的生理鹽水或 NE(4 g·L－1，0.5 μl)、酚妥拉明(4 g·L－1，0.5 μl)，給藥時間均為 2 min。觀察注藥前、后痛反應神經(jīng)元電活動的變化，電信號經(jīng)JSD-731-F前級放大器(信號的高頻過濾器:3 kHz，低頻率濾波器:0.01 s，放大倍數(shù):100-fold)放大，顯示于VC-9示波器(Nihon Konden，Japan)監(jiān)視，并用ST-CH707X型雙道磁帶錄音機記錄痛反應神經(jīng)元的電變化。每個痛反應神經(jīng)元的放電記錄3次，每2 min 1次，連續(xù)觀察30 min。

1.3 神經(jīng)元的定義 在NAc記錄的神經(jīng)元分為3種類型:(1)無關神經(jīng)元:對傷害性刺激或非傷害性刺激均沒有反應;(2)會聚神經(jīng)元:對傷害性刺激和非傷害性刺激均有反應;(3)痛反應神經(jīng)元:只對傷害性刺激有反應。痛反應神經(jīng)元可分為痛興奮神經(jīng)元(PENs)和痛抑制神經(jīng)元(PINs)。PENs的定義是指對傷害性刺激增加其放電頻率反應的神經(jīng)元;而PINs的定義是指對傷害性刺激降低其放電頻率反應的神經(jīng)元。該研究主要是觀察和記錄PENs和PINs的電活動。

1.4 觀察指標 凈增值(NIV，Hz)，是指 PEN或PIN在傷害性刺激前2 s內(nèi)放電平均頻率和傷害性刺激后誘發(fā)放電平均頻率之間差值。潛伏期(s)是指從傷害性刺激起到出現(xiàn)PEN放電的時間。抑制時程(ID，s)是指從傷害性刺激起到出現(xiàn)PIN放電之間的持續(xù)時間。

1.5 統(tǒng)計學方法 實驗結果經(jīng)Powerlab/8 s(ADInstruments)數(shù)據(jù)處理儀處理后輸入計算機，用Chart v 5.3軟件(Australian)進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示和用SPSS 16.0軟件進行分析。統(tǒng)計差異用重復測量方差分析和F檢驗。兩組間差異顯著性用LSD法。

2 結果

2.1 生理鹽水對嗎啡依賴大鼠NAc痛反應神經(jīng)元痛誘發(fā)電活動的影響 在生理鹽水組，NAc內(nèi)給予正常生理鹽水，嗎啡依賴大鼠的26 PENs或20 PINs的痛誘發(fā)電活動沒有明顯變化(Fig 1a和Fig 2a)。

2.2 NE對嗎啡依賴大鼠NAc痛反應神經(jīng)元痛誘發(fā)電活動的影響 在NE組，24 PENs的平均潛伏期是(0.15±0.03)s，而平均 NIV是(5.53±0.12)Hz。NAc內(nèi)注射NE后立刻，PENs的潛伏期開始增加，NIV開始下降(Fig 1b)。在給NE后8 min，這些作用達到高峰，即平均潛伏期為(0.69±0.02)s(F=3.174，P＜0.0001)，NIV 為(1.28±0.09)Hz(F=2.458，P＜0.0001)。在給 NE后0～16 min期間，PENs的平均潛伏期(F=60.167，P＜0.0001)和NIV(F=3.681，P＜0.0001)分別與生理鹽水組同期相比差異有顯著性(Fig 3)。在給NE 20 min后，PENs的潛伏期和NIV開始逐漸恢復。

18 PINs的平均ID是(1.70±0.04)s，而 NIV是(－2.68±0.12)Hz。NAc內(nèi)注射NE后，PINs的ID開始縮短，并NIV開始增加(Fig 2b)。在給NE后8 min，這些作用達到高峰，即平均 ID下降到(0.44±0.02)s(F=2.904，P＜0.0001)，而 NIV 增加到(－0.21±0.03)Hz(F=66.150，P＜0.0001)。在注射后的4～16 min，平均 ID(F=9.126，P＜0.0001)和NIV(F=1.455，P＜0.0001)出現(xiàn)了明顯變化與生理鹽水組同期相比(Fig 4)。

2.3 酚妥拉明對嗎啡依賴大鼠NAc痛反應神經(jīng)元痛誘發(fā)電活動的影響 在酚妥拉明組，22PENs的平均潛伏期為(0.16±0.02)s，而NIV為(5.13±0.14)Hz。NAc內(nèi)給予酚妥拉明后，PENs的潛伏期開始縮短，而NIV開始增加(Fig 1c)。這些效應在給藥后8 min達到高峰，平均潛伏期下降到(0.01±0.03)s(F=138.889，P＜0.0001)，而 NIV 增加到(9.77±0.18)Hz(F=1.432，P＜0.0001)。在給藥后4～12 min期間，PENs的平均潛伏期(F=5.596，P=0.031)和 NIV(F=3.138，P＜0.0001)分別與生理鹽水組同期相比差異有顯著性(Fig 3)。

Fig 1 Effects of intra-NAc microinjection of normal saline(a)or NE(b)，phentolamine(c)on the evoked discharges of PEN in the NAc of morphine-dependent rats

17 PINs的平均 ID為(1.68±0.05)s，而 NIV為(－2.78±0.09)Hz。在注射酚妥拉明后，ID開始延長，而NIV開始減少(Fig 2c)。在給予酚妥拉明后8 min，PINs的平均ID增加到(4.07±0.02)s(F=2.485，P＜0.0001)，而NIV下降到(－4.80±0.13)Hz(F=3.456，P＜0.0001)。在給藥后0～16 min期間，PINs的平均 ID(F=5.675，P＜0.0001)和NIV(F=1.955，P＜0.0001)分別與生理鹽水組同期相比有明顯差異(Fig 4)。在給予酚妥拉明后20 min，PINs的平均ID和NIV開始恢復。

Fig 3 Influences of intra-NAc microinjection of different substances on the latency(a)and NIV(b)of PENs in the NAc of morphine-dependent rats

3 討論

本研究觀察了NE和酚妥拉明對嗎啡依賴大鼠NAc內(nèi)PENs和PINs生物電活動的影響。該結果揭示，NAc內(nèi)給予NE可抑制PENs的電活動，而增強PINs的電活動;而酚妥拉明能增強PENs的電活動和抑制PINs的電活動。可見，酚妥拉明和NE兩者之間在嗎啡依賴大鼠NAc內(nèi)的作用是對立的。結果表明，NE參與嗎啡依賴大鼠NAc內(nèi)傷害性信息傳送的調制。此外，PENs和PINs可以被認為是疼痛研究的指標［9］。PENs和PINs對相同的物質具有相反的反應，這也許可以解釋NE和酚妥拉明對疼痛的調制作用。

Fig 4 Influences of intra-NAc microinjection of different substances on the ID(a)and NIV(b)of PINs in the NAc of morphine-dependent rats

NE是一種單胺神經(jīng)遞質，其對中樞痛覺調節(jié)作用相當復雜。我們研究室曾證明，尾核內(nèi)注射NE可增加嗎啡依賴大鼠尾核內(nèi)PEN的電活動，降低PIN的電活動，即出現(xiàn)了NE易化疼痛效應［10］。但側腦室注射NE能抑制嗎啡依賴大鼠核束旁的PEN電活動，加強PIN電活動，即表現(xiàn)出NE的鎮(zhèn)痛作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NAc內(nèi)注射NE也能產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果。由于NE廣泛地分布在大腦中。許多腦結構會聚于腦干組成了下行抑制系統(tǒng)，可調節(jié)脊髓痛覺的傳遞。NE、5-羥色胺(5-HT)等在下行抑制系統(tǒng)中起著重要的作用。NE能抑制外周C纖維傳送傷害性刺激信息到脊髓側角［3］。NE再攝取抑制劑，從而減輕初期由傷害性刺激引起的疼痛感覺［11］。單胺類，包括 NE、多巴胺(DA)，5 － HT 等，通過不同的神經(jīng)遞質受體亞型調節(jié)背角神經(jīng)元的興奮性和傷害性疼痛［12］。NE在基礎條件下對痛覺影響不大，但長期疼痛可通過負反饋促進NE介導抑制疼痛［13］。NE和5-HT通過在大腦和脊髓中的下行抑制途徑參與痛覺調制［14］。揭示，NE能系統(tǒng)和痛覺調制系統(tǒng)之間有著密切的關系。

NAc位于尾狀核吻側下方，視神經(jīng)管頂部。NAc接收來自谷氨酸能、5-HT能和NE能神經(jīng)元的投射。NAc中含有大量的內(nèi)源性阿片肽，在控制疼痛的傳送和調制起著重要的作用。NAc可通過阿片肽和膽囊收縮素之間的相互作用來調制疼痛。大量證據(jù)表明［15］，DA與NE由額葉前皮質NE能的末稍共同釋放的。NAc的主要神經(jīng)遞質是DA和NE，研究已證實在NAc內(nèi)，NE和DA神經(jīng)遞質的水平是相等的?？梢?，NAc是中樞痛覺調制系統(tǒng)中重要核團之一。

該系列結果揭示，NAc內(nèi)給予NE不僅可抑制嗎啡依賴大鼠NAc內(nèi)PEN的電活動，還能加強PIN的電活動，呈現(xiàn)出NE的鎮(zhèn)痛效應。當NAc內(nèi)給予α-受體拮抗劑酚妥拉明時，NAc內(nèi)PEN的電活動加強，而PIN的電活動減弱，表現(xiàn)出酚妥拉明易化疼痛效應。提示，NE或酚妥拉明是通過α-受體介導改變了NAc內(nèi)PEN和PIN的電活動來調控中樞痛覺的。

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