劉曉冬 徐 冶 王曉軍 孫璐陽 康 晶 曹慧玲

1.吉林醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林吉林 132011；2.吉林醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院科研實驗中心，吉林吉林 132011

微波治療腫瘤主要是利用其熱效應， 生物組織被微波輻照后，即吸收微波能，導致該區(qū)組織細胞內(nèi)的極性分子處于一種激勵狀態(tài)，發(fā)生高速振蕩，與鄰近分子頻頻磨擦而將微波能量轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?，從而使組織凝固、壞死。 微波治療配合放、化療可增加放、化療的作用，從而減少它們的劑量，提高療效。 目前伴隨對微波研究的不斷深入，尤其是在醫(yī)療領域的廣泛應用, 人們對微波治療腫瘤的機理有了新的認識。 研究證實，一定強度的微波輻射是通過熱和(或)非熱效應對機體造成損傷，所以微波治療腫瘤應包含熱和(或)非熱效應。 以往人們過多偏注于微波的熱效應，至于非熱效應的作用機制至今也不明確，尚無定論[1]。 實驗室及離體實驗結(jié)果更是眾說紛紜，因此解開微波的“非熱效應”之謎是當前急待解決的任務之一。該研究以人肺癌A549 細胞為研究對象，探討了微波非熱效應對組織細胞損傷的反應及其作用機制，以期為微波治療腫瘤提供新的思考方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

微波輻射儀為南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司，MY8C-1 型微波功率源。 Cytochrome c、GRP 78、Cathepsin D 鼠單克隆抗體,Caspase-3、Caspase-4 兔多克隆抗體， 均購自美國Santa Cruz 公司。 單丹磺酰尸胺染料（monodansylcaolaverine，MDC）、多聚賴氨酸均購自美國Sigma 公司。 激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus FV1000）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺癌A549 細胞株由吉林大學白求恩醫(yī)學院病理生理學教研室惠贈，細胞用含10%小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、100 U/mL 青霉素、0.1 mg/mL 鏈霉素的高糖完全培養(yǎng)基IMDM 培養(yǎng)基（Gibco,USA）在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。 取對數(shù)生長期細胞， 并調(diào)成2×105個／mL 接種于培養(yǎng)板，2～3 d 后細胞生長至70%融合用于實驗。

1.2.2 分組及非熱效應模型 將細胞培養(yǎng)板中A549 細胞按輻射強度分為: 100 W、150 W、200 W3 個實驗組。 同時設立未輻射的空白對照組，處理方式為除不接受微波輻射外，其它均與輻射組相同。 輻射時將細胞培養(yǎng)板放置于冰浴條件下，在輻射臺上依次進行輻射，每組輻射時間均為10 min，輻射距離為10 cm。輻射后立即采用溫度計測定細胞培養(yǎng)物溫度沒有升高， 以確保非熱效應模型的可靠性。 輻射后細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后分別收集每實驗組以及空白對照組的細胞進行相關檢測。

1.2.3 Western 印跡檢測凋亡相關蛋白 將實驗組（100 W、150 W、200 W） 及未輻射的陰性對照組細胞消化后收集于離心管，PBS清洗2 次，加入細胞裂解液冰上靜置15 min，10 000 g 離心15 min收集上清，得到樣品蛋白。 Bradford 法測定收集到的樣本的蛋白濃度，據(jù)此取等量蛋白。蛋白質(zhì)樣品與等量的2×SDS 凝膠加樣緩沖液混合均勻，煮沸變性，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白、然后轉(zhuǎn)膜并于室溫封閉，分別加入Cytochrome c、Caspase-3、GRP 78、Caspase-4、Cathepsin D 的一抗,4 ℃孵育過夜, 緩沖液洗膜4 次,每次15 min ,然后與辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，洗膜后加入免疫印跡化學發(fā)光劑DAB，室溫顯色20 min，暗室中X 線片曝光。 β-actin 作為內(nèi)參照，天能凝膠成像儀分析系統(tǒng)（TANON 2500R 型）獲取圖像并進行半定量分析。

1.2.4 MDC 染色法檢測溶酶體功能變化 細胞以5×104鋪于24孔板，按實驗分組細胞處理24 h 后：①PBS 洗2 遍，棄上清；②加入50 umol/L MDC 染液200 μL/孔，37 ℃溫育60 min； ③4%多聚甲醛500 μL/孔，固定15 min；④PBS 洗2 次，抗熒光淬滅劑封片。通過激光共聚焦顯微鏡 （Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM）觀察細胞內(nèi)溶酶體的變化，并取圖拍照。

2 結(jié)果

2.1 非熱效應對輻射細胞線粒體損傷

以β-actin 的吸光度值作為內(nèi)參照，對各組條帶的吸光度值進行校正，進行半定量分析。 與陰性對照組相比各輻射組細胞的胞質(zhì)內(nèi)Cytochrome c 蛋白水平明顯上調(diào)，并隨著輻射劑量增加。同時與陰性對照組相比，輻射組細胞的Caspase-3 蛋白的活化形式即cleaved caspase-3 表達明顯增加，這兩種蛋白是細胞線粒體凋亡途徑相關蛋白。 見圖1。

圖1 Western 印跡檢測Cytochrome、caspase-3 蛋白

2.2 非熱效應對輻射細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷

Western 印跡檢測陰性對照組以及輻射組細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白78(GRP78)，結(jié)果輻射組細胞的胞質(zhì)內(nèi)GRP78 蛋白水平明顯上調(diào)，并隨著輻射劑量增加。GRP78 蛋白在正常組織細胞中表達水平較低，但在低糖、低氧、酸中毒、細胞毒性免疫反應等應激情況下，GRP78 蛋白表達水平顯著升高。 同時與陰性對照組相比，輻射組細胞的Caspase-4 蛋白活化，這兩種蛋白是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白。 見圖2。

圖2 Western 印跡檢測GRP78、caspase-4 蛋白

2.3 非熱效應對輻射細胞溶酶體損傷

Western 印跡檢測結(jié)果顯示：與陰性對照組相比，微波輻射非熱效應可以導致A549 細胞溶酶體蛋白水解酶Cathepsin D 表達增加（圖3），此結(jié)果表明微波輻射后的非熱效應，可引起細胞溶酶體功能增強，釋放Cathepsin D 增多，并且是隨著輻射劑量而增加。Cathepsin D 是一種酸性溶酶體蛋白酶，在酸性環(huán)境中可溶解基底膜，降解細胞外基質(zhì)和結(jié)締組織，與侵襲性生物學行為有關。 同時MDC 染色后共聚焦顯微鏡觀察，顯示見實驗組熒光明顯增強，表明微波輻射非熱效應可以導致A549 內(nèi)的自噬情況增加，微波處理后的細胞胞漿中出現(xiàn)了大量的自噬泡，并且是隨著輻射劑量而增加。 進一步說明非熱效應導致受損細胞利用溶酶體降解自身損傷的細胞器和大分子物質(zhì)。 陰性對照組卻很少發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)自噬泡的生成。 見圖4。

圖3 Western 印跡檢測Cathepsin D 蛋白

圖4 MDC 染色共聚焦顯微鏡觀察溶酶體變化

3 討論

目前，伴隨微波的生物學效應及其機制研究不斷深入，微波對生物體的非熱效應引起了人們的極大關注。 非熱效應是指熱效應以外的微觀生物學效應。 很多學者認為，微波的非熱效應主要作用機制是作為一種信號作用于細胞膜， 通過細胞信息傳導激活控制細胞代謝和生長的酶系統(tǒng)， 導致相應的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平、細胞因子、信號通路等的改變，影響細胞的增殖和分化進而影響細胞的功能。 但由于各種理論未能完全闡明 “非熱效應”的作用機理，尤其是實驗的重復性也差，所以引起爭論。 該研究以A549 細胞為研究對象，建立微波輻射非熱效應模型，驗證“非熱效應”的存在，并且認為“熱效應”對組織細胞所造成的損傷反應可能是通過細胞線粒體、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體途徑共同所誘導的細胞凋亡。

該研究顯示， 微波輻射非熱效應致A549 細胞胞質(zhì)內(nèi)Cytochrome c 蛋白水平明顯上調(diào)， 并隨著輻射劑量而增加。 Cytochrome c 在線粒體電子傳遞鏈中負責傳遞電子, 釋放增多可使線粒體產(chǎn)生更多超氧陰離子自由基和H2O2 以及活性氧。 活性氧的積累又將導致線粒體膨脹,內(nèi)膜非特異性孔道產(chǎn)生,細胞色素c 從內(nèi)膜脫落并釋放到胞質(zhì)中，加劇活性氧的產(chǎn)生,引起氧化應激損傷細胞,促進細胞凋亡的發(fā)生[2]。 caspase-3 是細胞凋亡過程中最關鍵的執(zhí)行分子之一， 多數(shù)誘發(fā)凋亡的信號都要經(jīng)過caspase 的介導，最終由caspase-3 執(zhí)行細胞 凋亡[3]。 cleaved caspase-3 是caspase-3 活化時經(jīng)剪切產(chǎn)生的活性片段，是有活性的caspase-3，其表達程度可反應caspase-3 的活性狀態(tài)和細胞凋亡的大致情況。 該研究采用檢測cleaved caspase-3 的方法了解caspase-3 的激活狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，輻射組細胞的Caspase-3 蛋白明顯活化，認為微波輻射非熱效應對A549 細胞的線粒體造成一定的損傷，并啟動凋亡途徑。 微波輻射非熱效應導致A549 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，通過抑制蛋白合成、促進錯誤折疊蛋白降解等機制保護發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的細胞。 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78 即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白，屬于熱休克蛋白70 家族成員，其在促進蛋白加工、成熟以及維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。 多種擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的刺激均能夠誘導GRP78 表達[4-5]。 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應過程中，GRP78 的誘導表達對應激細胞抵抗凋亡和恢復正常功能具有重要意義。 Caspase-4 是鼠類凋亡蛋白Caspase-12 的人類同源物，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激持續(xù)活化時被激活， 活化下游Caspase 蛋白激酶，caspase-12 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導調(diào)亡的關鍵分子[6-8]。該研究結(jié)果顯示輻射組細胞胞質(zhì)內(nèi)的GRP78 蛋白水平明顯上調(diào)， 并隨著輻射劑量增加，表明微波輻射非熱效應對A549 細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)造成一定的損傷，并通過高表達GRP78 蛋白抵抗凋亡。 但是隨后Caspase-4 蛋白的表達增加表明損傷加重，分析認為GRP78 與caspase12 交互作用共同調(diào)控著凋亡的發(fā)生。 具體調(diào)控機制還有待進一步深入的研究。 至于Cathepsin D 是溶酶體內(nèi)的天冬氨酰蛋白酶，在多種病理條件下可見其表達增加，與細胞溶酶體途徑凋亡密切相關[9]。 MDC 染色曾經(jīng)被作為自噬體的標志，廣泛用于自噬檢測。 然而，目前的研究顯示MDC 是與細胞內(nèi)酸性囊泡結(jié)合（溶酶體或自噬性溶酶體）而不是特異的結(jié)合自噬體。 該研究中隨著微波劑量的增加，Western 印跡檢測結(jié)果顯示， 溶酶體Cathepsin D 蛋白表達增高,通過共聚焦顯微鏡觀察MDC 染色明顯增強，提示微波輻射非熱效應可以導致溶酶體途徑凋亡發(fā)生，并且微波輻射非熱效應對A549 細胞誘導凋亡作用呈現(xiàn)劑量依從性。

微波是300 MHz～300GHz 頻率范圍內(nèi)的非電離輻射， 伴隨著廣泛應用于雷達、航空、通信工業(yè)以及醫(yī)學領域，人們曝露于微波輻射的機會越來越多， 微波輻射可能產(chǎn)生生物效應及其對健康的影響已經(jīng)受到公眾以及研究人員的非常關注。 Omura 等人研究認為環(huán)境中，例如彩電、計算機、微波爐、移動電話等產(chǎn)生的電磁場對人體的影響包括甚至是以“非熱效應”為主。 而微波“非熱效應”對生物體產(chǎn)生的影響是復雜的，多數(shù)學者認為其生物學功效是多基因協(xié)同調(diào)控及蛋白表達所產(chǎn)生的作用， 這與該研究的結(jié)論是一致的，但具體分子機制還尚未闡明。 今后有關微波對腫瘤細胞的作用及其誘導凋亡不同途徑之間的關系的更深入研究，必將為充分、合理利用微波治療腫瘤提供新線索，同時也將為微波有效防護提供一定新的理論依據(jù)。

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