楊依依 YANG Yiyi

王 青1 WANG Qing

黃慶華2 HUANG Qinghua

張文靜1 ZHANG Wenjing

馮前進1 FENG Qianjin

陳武凡1 CHEN Wufan

2. 華南理工大學電子與信息學院 廣東廣州510640

關(guān)節(jié)軟骨是一種表面光滑、富有彈性的結(jié)締組織，可減少運動過程中骨面之間的摩擦，能夠最大限度地吸收、緩沖應力作用[1]。然而關(guān)節(jié)軟骨損傷或退化后，其功能降低，導致骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生或進行性加重。軟骨基質(zhì)成分的分解和結(jié)構(gòu)的破壞是骨性關(guān)節(jié)炎的早期病理特征[2]。骨性關(guān)節(jié)炎的臨床診斷方法各有優(yōu)缺點，在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨成像中均有局限性[3]。定量超聲成像（QUI）是定量研究軟骨的成熟度、軟骨形態(tài)、軟骨組織修復的一種方法[3-5]。使用QUI可以定量評估軟骨表面的粗糙度、膠原蛋白網(wǎng)絡的完整性、軟骨厚度、組織的反射系數(shù)（RC）及衰減系數(shù)等，從而判定軟骨的退化程度[3]。因此，本研究采用定量超聲成像QUI測量退化軟骨樣本的超聲參數(shù)，并分析其與蛋白多糖和膠原蛋白含量的相關(guān)性，以探討QUI在評估骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取21塊新鮮成年豬的髕骨，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑無破損，髕骨的外側(cè)部分為超聲掃描部位。將髕骨樣本放入－20℃冰箱保存待用。實驗前，將樣本置于磷酸緩沖溶液（PBS）中解凍2 h（室溫保持25℃）。將21塊豬髕骨軟骨樣本隨機平均分為3組：①正常組：作為參考樣本，不做任何處理；②胰蛋白酶消化組（Trypsin組）：在0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液中浸泡4 h，消化降解軟骨組織內(nèi)的蛋白多糖；③膠原蛋白酶消化組（Collagenase組）：在30 U/ml膠原蛋白酶溶液中浸泡24 h，破壞軟骨組織內(nèi)的膠原蛋白。這樣就建立了經(jīng)酶退化的軟骨離體退化模型以模擬自然骨性關(guān)節(jié)炎軟骨的退化。消化過程在37℃恒溫箱內(nèi)進行。消化完成后，使用pH=7.4的PBS沖洗軟骨樣本3次后，進行超聲掃描測量。

1.2 儀器與方法 采用開放式綜合QUI系統(tǒng)（Sonix RP,Ultrasonix, Canada），系統(tǒng)具備一個中心頻率為10 MHz的線陣超聲探頭，－6 dB帶寬為5~14 MHz，可進行實時線陣掃描。系統(tǒng)內(nèi)配置采樣頻率為40 MHz的10位模/數(shù)轉(zhuǎn)換卡，以45幀/s的采樣速度獲取二維超聲圖像。掃描軟骨樣本時，先將耦合劑涂于軟骨表面，把超聲探頭置于軟骨表面上方約9.56 mm處，使超聲波垂直入射軟骨組織，設置系統(tǒng)增益以獲得清晰的軟骨超聲圖像，在之后的實驗過程中，系統(tǒng)增益的設置始終保持一致。軟骨組織產(chǎn)生的超聲回波信號經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換卡存入計算機，待信號處理和超聲參數(shù)計算。軟骨QUI系統(tǒng)見圖1。

圖1 軟骨定量超聲成像系統(tǒng)

1.3 感興趣區(qū)（ROI）的確定 在超聲圖像上接近軟骨面中央的位置手繪選定ROI，區(qū)域內(nèi)包含20根超聲掃描線，盡量避開軟骨兩側(cè)的區(qū)域，以避免部分軟骨面存在的彎曲度問題。

1.4 QUI圖像信號處理和超聲參數(shù)計算 使用QUI對3組軟骨樣本依次進行掃描后，得到軟骨的超聲射頻信號（圖2A）。為了界定軟骨表面及軟骨-骨界面的輪廓線，將超聲回波信號進行希爾伯特（Hilbert）變換，獲得其包絡信號（圖2B）。設置2個窗口來選定軟骨表面及軟骨-骨界面的回波，尋找窗內(nèi)波幅最大的位置，以確定軟骨表面及軟骨-骨界面的位置，由20根掃描線的波幅最大的位置分別勾勒出軟骨表面及軟骨-骨界面的輪廓線。

圖2 軟骨超聲射頻信號和經(jīng)希爾伯特變換后的包絡信號。A. 超聲射頻信號；B.超聲射頻信號經(jīng)希爾伯特變換后的包絡信號

超聲參數(shù)包括軟骨的表面粗糙度系數(shù)（ultrasound roughness index, URI）、 軟 骨 厚 度（thickness） 和 軟骨表面的反射系數(shù)（ref l ection coeff i cient of cartilage surface, RC）。軟骨厚度可由軟骨表面及軟骨-骨界面的輪廓線可確定軟骨的厚度，計算方法：

其中，TOFi為在軟骨表面及軟骨-骨界面之間的超聲波傳播時間，Ccartilage為超聲在軟骨組織的平均聲速1675 m/s[6]，m為掃描線數(shù)20。URI表示軟骨表面的粗糙或平滑程度，可由軟骨表面的輪廓線確定，計算方法[7]：

其中， di是沿第i條掃描線軟骨表面到換能器的距離，di等于超聲的傳播時間除以2再乘以聲速。超聲在耦合劑中的傳播速度為1540 m/s， 是 di（i=1,2,3…20）的平均值。因考慮到關(guān)節(jié)軟骨表面的輪廓線曲度對URI計算的影響，本研究首先使用高通濾波器進行濾波，濾波后計算的URI可真實反映軟骨表面的粗糙或平滑程度。RC可由軟骨樣本的超聲回波的最大幅值與參考樣本的超聲回波的最大幅值的比值得到，計算方法[8]：

其中，Ai是軟骨表面的超聲回波的最大幅值，是 Ai（i=1,2,3…20）的平均值，是參考幅值，計算時使用不銹鋼板面的超聲回波反射幅值作為參考幅值，是（i=1,2,3…20）的平均值。信號的處理和超聲參數(shù)的計算均采用自編的Matlab (V7.0) 程序完成。1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件，運用非參數(shù)統(tǒng)計方法以排除因樣本量小帶來的“隨機顯著性”[9]，使用Mann-Whitney U檢驗比較3組樣本間各參數(shù)的差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲掃描結(jié)果 正常組軟骨表面回波強、清晰光滑；而消化組（Trypsin組和Collagenase組）軟骨表面回波減弱，表面輪廓變得不清晰光滑。見圖3。2.2 超聲參數(shù)結(jié)果 Trypsin組和Collagenase組RC均顯著小于正常組（P<0.01），且兩消化組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Trypsin組和Collagenase組URI均顯著大于正常組（P<0.01），但兩消化組間URI差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與正常組軟骨厚度相比，雖然Trypsin組軟骨組織無顯著增厚（P>0.05），且Collagenase組亦無顯著變?。≒>0.05），但兩消化組軟骨厚度差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 3組軟骨表面RC、URI及軟骨厚度比較

2.3 超聲參數(shù)與軟骨成分的相關(guān)性 圖4所示為軟骨成分改變與軟骨表面RC及URI改變之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用RC與URI可以很好地區(qū)分正常軟骨與退化軟骨, 并進一步區(qū)分退化軟骨中的具體成分如蛋白多糖或膠原蛋白的缺失。正常組RC均高于兩消化組，而URI則低于兩消化組。隨著Trypsin組內(nèi)蛋白多糖的降解和Collagenase組內(nèi)膠原蛋白的破壞，軟骨表面RC逐漸減小，URI逐漸增大。

圖4 3組軟骨表面超聲參數(shù)與軟骨成分之間的關(guān)系

3 討論

在表征退化的關(guān)節(jié)軟骨組織的研究中，超聲是一種有效的研究工具[3]。小動物（如兔、大鼠等）的軟骨組織一般采用高頻（50~55 MHz）超聲成像系統(tǒng)得到清晰的軟骨超聲圖像[10,11]。由于較大型動物（如豬）的軟骨較厚（>1 mm），本研究采用中心頻率為10 MHz的QUI系統(tǒng)也可以清晰地分辨軟骨表面與軟骨-骨界面。

本研究運用QUI測量軟骨表面的超聲參數(shù)發(fā)現(xiàn)，隨著軟骨中不同成分的分解，軟骨表面的超聲參數(shù)也隨之發(fā)生改變。正常軟骨和退化軟骨之間存在明顯差異，由于正常軟骨組織表面平滑，隨著蛋白多糖與膠原纖維網(wǎng)絡的分解，軟骨組織表面隨之變得不平整。雖然兩個消化組間URI差異無統(tǒng)計學意義，但與胰蛋白酶消化的軟骨表面相比，膠原蛋白酶消化的軟骨表面更不平整，這可能是由于膠原纖維在軟骨表層占主導地位，表層的膠原纖維網(wǎng)絡的分解是引起軟骨表面URI增大的主要原因，而蛋白多糖成分在軟骨表層含量較少，但胰蛋白酶除消化軟骨蛋白多糖外，對部分膠原蛋白也有影響[7]。

關(guān)節(jié)軟骨成分的改變不僅引起表面粗糙不平，而且引起軟骨組織表面的RC顯著減小，其主要原因可能有兩個：一是由于軟骨表面粗糙程度增大，造成超聲信號的漫反射，導致界面回波幅度減??；二是由于軟骨內(nèi)成分和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，尤其是膠原蛋白的分解，使得更多的超聲能量被透射吸收，也會造成軟骨表面RC減小。早期研究發(fā)現(xiàn)，隨著關(guān)節(jié)炎等級的升高，軟骨組織表面的RC逐漸減小[11]，與本研究結(jié)果相似。因此，酶消化方法與前十字韌帶切除術(shù)引入關(guān)節(jié)炎的方法對軟骨表面有相似的影響。這兩種方法均為目前普遍采用的骨性關(guān)節(jié)炎動物造模實驗方法，并且這種酶消化模型特別適合軟骨退變過程中軟骨成分改變的研究。

軟骨表面的超聲參數(shù)（URI 和RC）是描述軟骨退化的重要指標，本研究結(jié)果表明，運用QUI測量這兩個參數(shù)可很好地區(qū)分正常軟骨與退化軟骨，可以評估退化軟骨中的具體成分（蛋白多糖或膠原蛋白）的缺失情況。另外，本研究與其他研究結(jié)果均表明，QUI能有效發(fā)現(xiàn)早期關(guān)節(jié)炎軟骨退化[3,5-12]，并可為其提供較客觀的定量超聲診斷，為骨性關(guān)節(jié)炎的早期診斷提供參考。

就目前的醫(yī)療水平而言，當患者出現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀或影像學上表現(xiàn)異常時，病情已到中晚期，只能依靠手術(shù)正畸或緩解癥狀。既往研究表明，關(guān)節(jié)軟骨的退化發(fā)生于早期骨性關(guān)節(jié)炎，并與軟骨組織成分結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[1,3,7,11,12]，因此，軟骨退化的早期發(fā)現(xiàn)對于骨性關(guān)節(jié)炎的干預和治療具有重要意義。作為一種廉價、易操作的檢測方法和實驗手段，許多學者應用QUI研究了退化過程中軟骨成分的變化和力學性質(zhì)的變化，探討了超聲聲學參數(shù)變化與軟骨成分變化的相關(guān)性，以及運用QUI觀測軟骨自由膨脹過程中內(nèi)部組織的形變。這些研究大多為實驗研究，但已開始嘗試性地將QUI應用于臨床研究，如新型小型按壓式超聲探頭和關(guān)節(jié)腔鏡式超聲探頭[5,8,13]，可用于關(guān)節(jié)炎術(shù)中實時評價軟骨的退化程度。但由于超聲穿透能力和關(guān)節(jié)腔的特殊解剖結(jié)構(gòu)，限制了QUI在臨床研究中的非侵入性應用，目前QUI僅可用于關(guān)節(jié)開腔手術(shù)或微創(chuàng)侵入性關(guān)節(jié)腔手術(shù)。

[1] Mow VC, Gu WY, Chen FH. Structure and function of articular cartilage and meniscus// Mow VC, Huiskes R. Basic orthopaedic biomechanics and mechano-biology. 3rd ed.Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2005: 181-258.

[2] Wang Q. Ultrasonic characterization of transient and inhomogeneous swelling behavior and progressive degeneration of articular cartilage. Hong Kong: Hong Kong Polytechnic University, 2007.

[3] Nieminen HJ, Zheng Y, Saarakkala S, et al. Quantitative assessment of articular cartilage using high-frequency ultrasound: research findings and diagnostic prospects. Crit Rev Biomed Eng, 2009, 37(6): 461-494.

[4] Aula AS, T?yr?s J, Tiitu V, et al. Simultaneous ultrasound measurement of articular cartilage and subchondral bone.Osteoarthritis Cartilage, 2010, 18(12): 1570-1576.

[5] Laasanen MS, T?yr?s J, Hirvonen J, et al. Novel mechanoacoustic technique and instrument for diagnosis of cartilage degeneration. Physiol Meas, 2002, 23(3): 491-503.

[6] Patil SG. Measurement of the sound speed in articular cartilage invitro. Hong Kong: Hong Kong Polytechnic University, 2005.

[7] Saarakkala S, T?yr?s J, Hirvonen J, et al. Ultrasonic quantitation of superficial degradation of articular cartilage.Ultrasound Med Biol, 2004, 30(6): 783-792.

[8] Virén T, Saarakkala S, Tiitu V, et al. Ultrasound evaluation of mechanical injury of bovine knee articular cartilage under arthroscopic control. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control, 2011, 58(1): 148-155.

[9] Laasanen MS, Saarakkala S, T?yr?s J, et al. Site-specific ultrasound ref l ection properties and superf i cial collagen content of bovine knee articular cartilage. Phys Med Biol, 2005,50(14): 3221-3233.

[10] Chérin E, Sa?ed A, Laugier P, et al. Evaluation of acoustical parameter sensitivity to age-related and osteoarthritic changes in articular cartilage using 50-MHz ultrasound. Ultrasound Med Biol, 1998, 24(3): 341-354.

[11] Niu HJ, Wang Q, Wang YX, et al. Ultrasonic reflection coefficient and surface roughness index of OA articular cartilage: relation to pathological assessment. BMC Musculoskelet Disord, 2012, 13: 34.

[12] Wang SZ, Huang YP, Saarakkala S, et al. Quantitative assessment of articular cartilage with morphologic, acoustic and mechanical properties obtained using high-frequency ultrasound. Ultrasound Med Biol, 2010, 36(3): 512-527.

[13] Hattori K, Takakura Y, Ishimura M, et al. Differential acoustic properties of early cartilage lesions in living human knee and ankle joints. Arthritis Rheum, 2005, 52(10): 3125-3131.