趙 喜，王新楊，黃金華，凌 勇

（南通大學醫(yī)學院藥學實驗室，江蘇226001）

金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是醫(yī)院感染中最常見的病原菌,可以引起敗血癥、菌血癥、呼吸道感染、人工關節(jié)感染、尿路感染、骨髓炎、傷口感染等多種疾病。隨著抗生素的廣泛應用，細菌的耐藥性呈上升趨勢，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus epidermids,MRSE)在臨床上耐受多種抗菌藥物。截短側耳素是高等真菌擔子菌綱側耳素屬Pleurotus mutilus和Pleurotas passeck-rianus菌種經(jīng)深層培養(yǎng)產(chǎn)生的一種廣譜的二萜烯類抗生素，主要對革蘭陽性菌和支原體有活性作用[1]。為尋找抗耐藥菌的超級抗生素，本研究擬對已合成出的C-14位處側鏈上帶有雜環(huán)的一系列新型截短側耳素衍生物，進行系統(tǒng)抗菌活性測試，為臨床應用提供更多的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與菌株 阿莫西林（山東淄博新達制藥有限公司，批號101224），泰妙菌素（江蘇賽奧生化有限公司，批號110319），新型截短側耳素衍生物15，16a和 16b（本實驗室合成）。MRSE,MRSA,甲氧西林敏感的表皮葡萄球菌 (methicillin-susceptible Staphylococcus epidermids,MSSE)及甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌 (methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA)菌株（臨床標本分離菌株，由江蘇南京鼓樓醫(yī)院提供），MH培養(yǎng)基(北京三藥科技開發(fā)公司，批號110217)；MH肉湯(北京陸橋技術有限責任公司，批號110321)。

1.2 儀器 TDR-200B型自動微生物鑒定系統(tǒng) (湖南長沙天地人生物科技有限公司)；DL-CJ-1F實驗醫(yī)用型潔凈工作臺(哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司北京分公司)；DH3600AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；一次性使用培養(yǎng)板(江蘇姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司，批號：20090218)。

1.3 方法

1.3.1 藥液的制備:采用微量肉湯二倍稀釋法[2]：取8排12孔的一次性使用培養(yǎng)板，分別標記，在標號1～12孔中各加入MH肉湯培養(yǎng)液100 μL，在每排的第1 孔各加入原藥液 100 μL(50 μg·mL-1)，將第 1 孔混勻后，抽取100 μL加入第2孔，將第2孔混勻后再抽取100 μl加入第3孔，依次倍比稀釋至第10孔，將第10孔混勻后抽取100 μL棄去，第11、12孔分別作陽、陰性對照。1～10孔中藥液濃度依次為：25．00、12．50、6．25、3.13、1.57、0.79、0.39、0.20、0.10、0.05 μg·mL-1。

1.3.2 菌液的制備:從已分離純化并過夜新鮮培養(yǎng)的細菌平板上挑取4～5個菌落，接種于MH肉湯中增菌6 h。菌液用3 mL MH肉湯以比濁儀校正濁度至 0.5 McFarland，再用 MH肉湯稀釋至 1.5×105cfu·mL-1，作為試驗菌液。

1.3.3 MIC的測定:用微量加樣器取100μL MRSA菌液，依次加入上述培養(yǎng)板第1～11孔中，使最終接種量為 5×105cfu·mL-1，37℃恒溫培養(yǎng) 18～20 h，觀察細菌生長情況，培養(yǎng)液澄清的為陰性 (即無細菌生長)，混濁的為陽性（即有細菌生長）。以無菌生長96孔平板的最低藥物濃度為該藥對該株細菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)。

2 結 果

阿莫西林對金黃色葡萄球菌的MIC值為4μg·mL-1，而新型截短側耳素衍生物15，16a,16b對金黃色葡萄球菌的MIC值均小于1μg·mL-1，抑菌效果明顯優(yōu)于阿莫西林,見表1。

表1 新型截短側耳素衍生物對金黃色葡萄球菌 MIC 值（μg·mL-1）

新型截短側耳素衍生物15，16a,16b對表皮葡萄球菌的最低抑菌濃度也明顯小于阿莫西林，且對MSSE和MRSE的MIC值相同，見表2。

表2 新型截短側耳素衍生物對表皮葡萄球菌 MIC 值（μg·mL-1）

3 討 論

截短側耳素具有良好的抗菌活性，1951年Kavanagh等[3]首次發(fā)現(xiàn)、定義并分離了這種結晶狀抗菌物質(zhì)，把它命名為Pleuromutilin。1974年Sandoz研究所在截短側耳素的基礎上，經(jīng)過半合成生成了高活性的動物專用抗生素泰妙菌素(Tiamulin)，其水溶性和抑菌效果均較截短側耳素有較大提高，對志賀菌、克雷伯菌以及大腸埃希菌顯示較強活性，并被推薦為控制豬支原體感染首選藥物[4]。隨著全球濫用抗生素的趨勢越來越嚴重，耐藥菌感染引起的疾病引起科學家的極大重視，2007年葛蘭素公司以截短側耳素為原料開發(fā)出了第一個人用截短側耳素類抗生素瑞他莫林(Retapamulin)，用于治療金葡萄球菌或化膿性鏈球菌引起的膿皰瘡[5-6]，該藥已于2008年在美國成功上市，商品名為Altargo，這是第一個人用截短側耳素衍生物，標志著此類抗生素實現(xiàn)了從獸用到人用的飛躍。

隨著抗菌藥物的廣泛應用，出現(xiàn)了大量的臨床耐藥致病菌。MRSA和MRSE都是醫(yī)院感染的重要致病菌，由于對多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性,它導致的各種感染治療困難，病死率較高，因此，研究探索抗MRSA和MRSE的有效藥物已勢在必行。為了提高截短側耳素的水溶性和抑菌效果，本實驗室合成了C-14位處側鏈上帶有雜環(huán)的一系列新型截短側耳素衍生物，并對這些衍生物進行體外抗菌活性測定。結果顯示，新型截短側耳素衍生物15,16a,16b對MRSE、MRSA、MSSE和 MSSA均有較強的抑菌作用，最低抑菌濃度明顯小于阿莫西林和泰妙菌素，且新型截短側耳素衍生物15,16a對MRSA的MIC低于MSSA。我們還發(fā)現(xiàn)新型截短側耳素衍生物15,16a,16b對MSSE和MRSE的抑菌效果幾乎一樣，這可能給MRSE引起的感染提供了一種新的治療藥物，為今后合成抗菌作用更強的新型截短側耳素衍生物打下基礎。

[1]吳雪萍，孫鳳霞，蘇為科,等．截短側耳素的HPLC測定[J]．河北科技大學學報，2008，29（1）：53-56.

[2]Murray PR，Baron EJ，Pfaller MA，et al．Antibacterial susceptibility tests：dilution and disk diffusion methods．Manual of clinical microbiology[M]．9th ed．Washington DC：ASM Press，2007：1110-1117．

[3]黃宇琪，張怡，胡昌華．截短側耳素產(chǎn)生菌的鑒定及發(fā)酵培養(yǎng)基初篩 [J]．四川大學學報 (自然科學版)，2008，45（3）：699-702.

[4]Hunt E.Pleuromutilin antibiotics[J].Drugs Fut,2000,25(11):1163-1168.

[5]劉黨生譯.治療人革蘭陽性球菌皮膚感染的截短側耳素類抗生素Retapamulin[J]．國外醫(yī)藥:抗生素分冊，2008，29（1）：28-31．

[6]Ronald N，Jones RN,Thomas R,et al.Activity of retapamulin(SB-275833),a novel pleuromutilin,against selected t resistant gram-positive Cocci cocci[J]．Antimicrob Agents Chemother,2006,50(7)：2583-2586．