程國山，游新才，武 艷，張今今，①

(1.陜西師范大學生命科學學院，陜西西安710062;2.陜西省紫陽縣茶葉研究所，陜西紫陽725300)

茶樹〔Camellia sinensis(Linn.)O.Ktze.〕隸屬于山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia Linn.)，為多年生喜溫葉用經濟植物，原產于中國云南，自然分布于中國西南和華南，在東南亞北部也有分布。隨著人類的引種栽培活動范圍擴大，茶樹的種植區(qū)域也由南向北逐漸遷移。近年來由于全球氣溫變化不穩(wěn)定，“倒春寒”和“霜凍”等低溫寒害在中國茶區(qū)頻繁發(fā)生，嚴重影響茶葉的產量和品質，低溫已經成為制約茶葉產業(yè)發(fā)展的最主要的氣象災害［1］。因此，研究茶樹的抗寒機制、篩選優(yōu)良的茶樹抗寒基因、提高茶樹抵御低溫災害的能力，已經成為茶葉科學領域重要的研究課題之一。

陜西省秦巴山區(qū)種茶產茶歷史悠久，茶樹資源分布廣泛，遺傳多樣性豐富［2］。陜南茶區(qū)作為中國茶樹適宜生長區(qū)的最北緣，較南方茶區(qū)緯度高且年平均氣溫低。在經歷漫長的繁衍和進化過程后，長期處于低溫環(huán)境中的秦巴山區(qū)地方茶樹種質有可能產生對低溫脅迫耐受的形態(tài)和生理生化特征，具備一定的抗寒性。鑒于此，在前期對23個陜西地方茶樹品種以及6個外地引進茶樹品種的抗寒性進行綜合評價的基礎上，作者所在的研究小組篩選出了包括‘紫陽圓葉’(‘Ziyangyuanye’)在內的陜西省特有的優(yōu)良抗寒茶樹品種［3］。

早期茶樹抗寒性研究多集中在茶樹葉片解剖結構與抗寒性關系以及低溫脅迫下葉片細胞原生質膜透性、水分含量、抗氧化酶類活性和光合作用或呼吸作用強度等生理生化指標的變化方面［4-6］。隨著分子生物學理論和技術的不斷發(fā)展，有關茶樹低溫脅迫和抗寒性分子機制的研究取得了顯著進展。目前，通過對低溫和常溫下基因表達差異進行比較以分離茶樹在低溫脅迫下差異表達的基因是茶樹抗寒性分子機制研究的主要方法［7-8］。在用于克隆差異表達基因的方法中，DDRT-PCR技術所需的RNA量少、重復性好，是分析植物基因差異表達的有利工具，已被廣泛應用于植物抗逆性研究［9］。

近年來，以陜西地方茶樹種質為材料的抗寒性研究也有報道，但僅局限于葉片解剖結構和低溫脅迫下茶樹葉片生理生化指標的變化等方面［3，10］，而對低溫脅迫誘導下茶樹特異基因的表達和茶樹抗寒性分子機制的研究尚未見報道。為了更全面地發(fā)掘和了解陜西特有的茶樹抗寒種質中的相關基因及其功能，作者利用DDRT-PCR技術，分析了經低溫脅迫不同時間后抗寒茶樹品種‘紫陽圓葉’基因差異表達的結果，并通過半定量RT-PCR驗證差異表達基因的表達特性，以期揭示茶樹抗寒性的分子機制，為通過基因工程技術提高中國北方茶區(qū)茶樹的抗寒性奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為優(yōu)良抗寒茶樹品種‘紫陽圓葉’(‘Ziyangyuanye’)，取自陜西省安康市紫陽縣茶葉試驗站。錨定引物和隨機引物為上海生工生物工程技術服務有限公司產品;DNaseⅠ (RNase-free)、MMLV反轉錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs和DL2000 Marker等購自寶生物工程(大連)有限公司。所用儀器為PTC-200 PCR儀和Sequi-Gen GT測序電泳儀(Bio-Rad)、Microfuge 22R離心機(Beckman Coulter)、Tanon-1600全自動凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)、NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計(Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 低溫處理方法 挖取長勢良好、無病蟲害、株高約30 cm的2年生扦插苗，移栽至陜西師范大學遺傳學實驗室的人工氣候箱(溫度25℃、空氣相對濕度65%)中培養(yǎng)，并按統(tǒng)一標準進行水肥管理。待茶樹苗生長穩(wěn)定后置于人工氣候箱中于4℃進行低溫處理，處理時間分別為0、8、12、24和48 h，每一處理組4株扦插苗，3次重復。低溫處理結束后在扦插苗對應位置上取當年生新梢第2和第3枚真葉，迅速置于液氮中冷凍后，于-80℃冰箱中保存、備用。

1.2.2 總RNA提取和cDNA第1鏈合成 取凍存葉片約 500 mg，采用改良的 SDS-酸酚法［11］提取總RNA;用質量體積分數1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，并用超微量紫外分光光度計測定其純度和濃度。反轉錄引物分別為 B0327、B0328和B0329(序列見表1)，以總RNA為模板，參照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)使用說明書合成cDNA第1鏈。

1.2.3 DDRT-PCR分析 以反轉錄合成的cDNA第1鏈為模板，用 3條錨定引物(B0327、B0328和B0329)與7條隨機引物(B0305～B0311)(序列見表1)組成21個引物對組合，分別進行RT-PCR擴增反應，重復2次。擴增程序為:94℃預變性1 min;94℃變性30 s，45℃退火2 min，72℃延伸30 s，共40個循環(huán);最后于72℃延伸10 min。取擴增產物4 μL，加入3 μL上樣緩沖液于95℃變性5 min，冰浴3 min后用質量體積分數6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色，拍照記錄實驗結果。

表1 用于茶樹品種‘紫陽圓葉’基因DDRT－PCR的引物序列Table 1 Primer sequences used for DDRT-PCR of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’gene

1.2.4 cDNA差異片段的回收、測序及分析 挑選差異片段，采用煮沸法回收并二次擴增，所用的引物對組合及擴增條件與上述DDRT-PCR分析相同;擴增產物用質量體積分數1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選僅有1條擴增產物且與DDRT-PCR擴增結果長度一致的片段，交由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果經GenBank和EST等數據庫BLASTn和BLASTx檢索，分析同源性。

1.2.5 半定量 RT-PCR分析與驗證 參照 Prime ScriptRT reagent Kit說明書反轉錄合成cDNA第1鏈。根據BLAST檢索結果并采用Primer Premier 5.0軟件設計相應引物，選擇功能明確的差異片段進行半定量RT-PCR，擴增產物經質量體積分數1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果和分析

2.1 總RNA提取及檢測結果

經質量體積分數1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，從經過4℃低溫處理不同時間的茶樹2年生扦插苗葉片中提取的總RNA的28S、18S和5S帶型清晰、銳度好且無彌散(圖1)。說明其總RNA較完整且無降解。用超微量紫外分光光度計測定吸光度(A)，結果顯示:A260/A280為1.9 ～2.0，A260/A230大于 2.0，表明獲得的RNA純度較高，可以用作反轉錄反應的模板。

圖1 低溫(4℃)脅迫不同時間后茶樹品種‘紫陽圓葉’葉片總RNA的電泳結果Fig.1 Electrophoresis result of total RNA of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’leaf after treated by low temperature(4℃)stress for different times

2.2 mRNA差異顯示結果

在4℃低溫條件下對茶樹品種‘紫陽圓葉’2年生扦插苗分別處理0、8、12、24和48 h，對5個處理組扦插苗葉片的反轉錄產物進行DDRT-PCR擴增，其中部分引物對的擴增結果見圖2。擴增結果顯示:共有12個引物對擴增出有明顯差異的cDNA片段。這些差異片段在低溫脅迫條件下表現為2種類型:第1類為抑制表達片段，即隨脅迫時間延長cDNA片段的強度呈減弱趨勢，如差異片段DF-8(圖2-A)和DF-2(圖2-B);第2類為誘導表達片段，在處理的開始階段(0 h)即表達但強度較弱，隨低溫處理時間延長這些片段的強度遞增，至處理24 h后達到最強，如差異片段DF-3(圖2-C)。

圖2 經低溫(4℃)脅迫不同時間后茶樹品種‘紫陽圓葉’的部分DDRT－PCR擴增圖譜Fig.2 A part of amplification pattern of DDRT-PCR of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’after treated by low temperature(4℃)stress for different times

2.3 差異片段的二次PCR擴增結果

通過上述DDRT-PCR擴增獲得差異片段，對差異片段回收后進行二次PCR擴增，擴增產物的電泳檢測結果顯示(圖3):差異片段DF-8、DF-2和DF-3的二次PCR擴增產物均為1條片段，且分子量與變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中一致。說明3條差異片段均為陽性。

圖3 經低溫(4℃)脅迫不同時間后茶樹品種‘紫陽圓葉’差異片段的二次PCR擴增圖譜Fig.3 Amplification pattern of the second PCR of differential fragments of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’after treated by low temperature(4℃)stress for different times

2.4 差異片段測序結果及同源性比對

差異片段DF-8、DF-2和DF-3經測序并通過BLASTn進行同源性比對，結果表明:差異片段DF-8長度為217 bp，與多個茶樹品種的谷氨酰胺合成酶基因片段有很高的同源性，與‘安吉白茶’(Camellia sinensis‘Anjibaicha’)和‘龍井 43’(C.sinensis‘Longjing 43’)的谷氨酰胺合成酶基因的同源性分別為96%和91%;與茶樹谷氨酰胺合成酶基因、‘安吉白茶’谷氨酰胺合成酶基因、茶樹細胞質谷氨酰胺合成酶基因和‘龍井43’細胞質谷氨酰胺合成酶基因的同源性序列mRNA的期望值分別為1e-76、7e-75、3e-28和2e-26;故以“茶樹谷氨酰胺合成酶基因片段(Csgsf，Camellia sinensis glutamine synthetase fragment)”命名。相關序列同源性的BLASTx比對結果顯示:Csgsf與多種植物谷氨酰胺合成酶基因高度同源，與菜豆(Phaseolus vulgaris Linn.)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)、油棕(Elaeis guineensis Jacq.)、西 洋 參 (Panax quinquefolius Linn.)和 水 稻(Oryza sativa Linn.)谷氨酰胺合成酶基因的同源性分別達到100%、97%、97%、97%和93%，因此推測該片段即為‘紫陽圓葉’谷氨酰胺合成酶基因片段。

差異片段DF-2和DF-3的堿基數分別為316和232 bp，均為低溫脅迫下差異表達的片段，故命名為“茶樹冷誘導基因片段(Cscaf，Camellia sinensis cold acclimation fragment)”，分別用Cscaf1和Cscaf2表示。EST數據庫的檢索結果顯示:Cscaf2與茶樹干旱脅迫誘導表達的cDNA的同源性為100%，與茶樹干旱抑制消減雜交文庫保守假定蛋白相似cDNA(CsSSHFD946)和茶樹干旱抑制消減雜交文庫未命名蛋白相似cDNA(CsSSHFD600)的期望值分別為1e-106和1e-101;而Cscaf1未能檢出同源序列，推測其為與冷脅迫相關的未知基因。

2.5 半定量RT－PCR結果

選擇經4℃低溫脅迫后茶樹葉片的下調表達片段Csgsf和Cscaf1及上調表達片段Cscaf2進行RTPCR驗證。結果見圖4。由圖4可見:Csgsf和Cscaf1在脅迫初始即表達，并隨著低溫脅迫時間的延長表達量逐漸降低;而Cscaf2在0 h表達較弱，隨著低溫脅迫時間的延長表達量逐漸增加，在脅迫48 h后達到最大。

圖4 經低溫(4℃)脅迫不同時間后茶樹品種‘紫陽圓葉’差異片段Csgsf、Cscaf1和Cscaf2的半定量RT－PCR結果Fig.4 Semi-quantitative RT-PCR result of differential fragments Csgsf，Cscaf1 and Cscaf2 of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’after treated by low temperature(4℃)stress for different times

3 討 論

本研究采用mRNA差異顯示技術，對陜西地方抗寒性茶樹種質‘紫陽圓葉’在5個不同時間段低溫脅迫處理下的cDNA進行分析，并通過差異cDNA片段的克隆、測序和功能分析，最終獲得3個與低溫脅迫相關的片段，分別為谷氨酰胺合成酶基因片段Csgsf和在低溫脅迫下表現應答的茶樹冷誘導基因片段Cscaf1和 Cscaf2。

谷氨酰胺合成酶(GS)為高等植物氨同化的關鍵酶。當ATP供能時，GS將催化還原為谷氨酰胺。GS的表達受組織器官特異性以及光照、溫度、鹽離子、土壤重金屬、水分脅迫及氮源形式等因素的影響［12-13］。Teixeir等［14］的研究結果表明:經鹽脅迫處理后，馬鈴薯(Solanum tuberosum Linn.)葉片中的 GS表達下調，根部的GS表達上調，說明鹽脅迫對馬鈴薯各器官中的GS含量有影響，其中葉片中的GS對鹽脅迫的敏感性較根部更強。此外，低溫也會明顯影響植物GS等氮素同化酶的活性。陸彬彬等［15］的研究結果表明:相對低溫會抑制水稻葉片中GS的活性;本研究結果也顯示:在低溫脅迫過程中Csgsf強度隨脅迫時間延長逐漸變弱;在低溫脅迫處理過程中的前8 h，Csgsf表達活性較高，但隨脅迫時間的延長，至脅迫16 h時其表達量明顯下降。據此可推測:低溫脅迫過程中茶樹葉片中谷氨酰胺合成酶基因的表達量隨脅迫時間的延長逐漸降低，呈下調趨勢，這與 Rana等［16］對4℃低溫處理后茶樹葉芽中GS的表達狀況的研究結果一致。Rana等［16］的研究結果還表明:GS除對低溫脅迫有響應外，在經過干旱和高溫等非生物因子脅迫處理后，茶樹葉芽中GS的表達量也均下調。推測茶樹GS基因啟動子區(qū)域可能有脅迫響應元件，從而導致基因表達量降低。

大多數植物葉片中包含2類GS，即胞液型GS(GS1)和葉綠體型GS(GS2)，其中GS1主要同化內源性蛋白質降解和氨基酸分解代謝產生的氨［17］。本研究結果和Rana等［16］的研究結果均表明:經低溫脅迫后茶樹葉片中的GS表達均減弱。其原因可能是:在溫度下降后葉片細胞中蛋白質分解代謝和光呼吸作用均減弱，導致內源性蛋白質和由光呼吸產生的均減少，進一步引起GS表達量下調、酶活性下降。相關的具體生化途徑和基因表達調控機制尚待進一步深入研究。

干旱脅迫與低溫脅迫對植物生理生化過程以及基因表達等的影響作用相似［18］，植物抗寒相關基因包括冷脅迫專一誘導基因和低溫誘導基因，其中，專一誘導基因只能被冷處理誘導［19］，而低溫誘導基因不僅能對低溫處理快速應答還能被水脅迫、短日照和ABA等脅迫誘導，如擬南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕的 RC12A 和 RC12B 等基因［20］。本研究中，茶樹冷誘導基因片段Cscaf2與茶樹干旱脅迫誘導下表達的cDNA同源性高達100%，由此可推測Cscaf2是對干旱和低溫等脅迫均有表現應答的基因片段。在基因數據庫中未能檢出茶樹冷誘導基因片段Cscaf1的同源序列，推測其可能是與冷脅迫相關的基因片段，具體功能還有待進一步研究。

低溫是影響茶樹生長發(fā)育、制約茶葉產業(yè)發(fā)展的最重要的非生物因子之一。陜西地方茶樹品種主要種植于秦巴山區(qū)，因長期適應低溫環(huán)境，比南方種植的茶樹品種的抗寒性相對更強。由于差異顯示技術的局限性，本研究未能從抗寒茶樹品種‘紫陽圓葉’中克隆獲得與茶樹抗寒直接有關的基因。但根據研究結果并結合相關文獻，Csgsf、Cscaf1和Cscaf2這3個cDNA片段的確參與了茶樹對低溫脅迫的應答，這3個片段的獲得不僅有助于茶樹抗寒性分子機制的深入研究，也為今后地方優(yōu)良茶樹種質資源的合理利用以及遺傳改良奠定了一定的研究基礎。

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