孫英晶，寧顯忠

(遼寧醫(yī)學(xué)院 附屬第三醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

血管緊張素Ⅱ-1型受體拮抗劑在腦出血大鼠治療中的作用

孫英晶，寧顯忠

(遼寧醫(yī)學(xué)院 附屬第三醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

目的探討血管緊張素Ⅱ-1型受體(AT1R)拮抗劑在大鼠腦出血治療中的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制。方法以膠原酶誘導(dǎo)法建立大鼠腦出血模型48只，隨機(jī)選取24只應(yīng)用AT1R拮抗劑奧米沙坦干預(yù)治療為治療組，24只為未治組。分別在造模成功后的24 h、48 h及72 h處死大鼠，取腦組織。用HE染色觀察腦組織病理學(xué)變化；用免疫組化及RT-PCR檢測(cè)兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦組織中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、AT1R和白細(xì)胞抗原CD40配體(CD40L)的表達(dá)，并分別采用平均光密度及灰度比值對(duì)各指標(biāo)表達(dá)做定量比較。用RT-PCR檢測(cè)并比較兩組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)腦組織RNA濃度。結(jié)果治療組腦內(nèi)AngⅡ、AT1R和CD40L在各時(shí)間點(diǎn)蛋白和基因表達(dá)及RNA濃度值均較未治組低，腦水腫減輕，差異有顯著性意義(P<0.05)。結(jié)論AT1R拮抗劑可使腦出血大鼠的炎癥因子含量減低，對(duì)神經(jīng)有保護(hù)作用。

腦出血；AT1R拮抗劑；免疫組化法；RT-PCR法

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是神經(jīng)內(nèi)科常見(jiàn)急癥，是腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管的自發(fā)性、急性破裂出血，占國(guó)內(nèi)腦卒中的17.1%～55.4%[1],由于目前治療缺乏特異有效的手段，僅限于降顱壓、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物或手術(shù)清除血腫，1個(gè)月內(nèi)病死率超過(guò)40%，大多數(shù)幸存者常遺留嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損[2]。為減少病死率及致殘率，人們對(duì)腦出血后腦組織損傷的機(jī)制進(jìn)行了研究。研究證實(shí)血腫周圍產(chǎn)生了炎性反應(yīng)[3-6],其中包括炎性細(xì)胞的局部浸潤(rùn)、炎性細(xì)胞因子的參與、補(bǔ)體的激活等,細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素類、腫瘤壞死因子等。白細(xì)胞分化抗原40(cluste of differentiation 40,CD40)屬于TNF-α受體超家族成員，和CD40L結(jié)合后，能導(dǎo)致TNF-α等細(xì)胞因子和其它神經(jīng)元毒素的產(chǎn)生，同時(shí)AngⅡ有促炎作用，并稱其為促炎因子[7]。AT1R拮抗劑減輕前炎癥反應(yīng)因子及醛固酮的釋放，且不減輕抗炎癥反應(yīng)因子糖皮質(zhì)激素的釋放已有報(bào)道[8-10]。本研究以膠原酶誘導(dǎo)法制備大鼠腦出血模型，應(yīng)用HE染色法觀察腦出血未治療及應(yīng)用AT1R拮抗劑奧米沙坦治療后腦組織病理變化，用免疫組化法及RT-PCR法檢測(cè)未治療及治療組不同時(shí)期腦組織AngⅡ、 AT1R、CD40L 等炎癥因子的含量和RNA濃度值變化，探討AT1R拮抗劑對(duì)腦出血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象及分組

遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康成年雄性Sprague-Daw ley(SD)大鼠，體重250～350 g，采用Ⅳ型膠原酶誘導(dǎo)法制作腦出血模型，其方法參照文獻(xiàn)[11]：術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，用10%水合氯醛腹腔麻醉，俯臥固定于立體定位儀，常規(guī)消毒，取雙耳間線與雙眼間線之間正中長(zhǎng)約1 cm做縱切口，暴露前囟和冠狀縫，于前囟前1 mm中線右旁開(kāi)3 mm處鉆一直徑約1.5 mm的圓孔，深達(dá)硬腦膜表面，用10 μL微量注射器抽?、粜湍z原酶2 μL(按0.2 U/μL配制)并將其固定于定位儀，沿鉆孔垂直進(jìn)針至硬膜下5.5 mm處，緩慢將Ⅳ型膠原酶推注入腦，停針2 min后退針至硬膜下3 mm處，再次停針2 min后完全退出顱外，醫(yī)用骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合皮膚，麻醉清醒后送至動(dòng)物房飼養(yǎng)。

取造模成功的48只隨機(jī)分為2組，治療組和未治組。分別在腦出血后24 h、48 h、72 h處死大鼠，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死8只。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)再分別取4只大鼠出血側(cè)腦組織用于HE染色及免疫組化檢測(cè)AngⅡ、 AT1R 、CD40L的蛋白表達(dá)，4只大鼠用于RT—PCR檢測(cè)AngⅡ、 AT1R 和CD40L的基因表達(dá)及RNA濃度值測(cè)定。

1.2 方法

給藥方法：腦出血治療組造模后2 h予奧美沙坦按28 mg/Kg體重溶于2 mL生理鹽水灌胃給藥，給藥后第1個(gè)24 h及第2個(gè)24 h分別再給未處死的大鼠同樣的藥物灌胃；腦出血未治療組在造模后2 h給予和治療組灌胃藥液等體積的生理鹽水，灌胃后第1個(gè)24 h及第2個(gè)24 h分別再給未處死的大鼠同樣的生理鹽水灌胃。

HE染色方法：(1)切片常規(guī)脫蠟、水化，自來(lái)水沖洗2～3 min；蘇木素染色3 min,自來(lái)水沖洗1 min；(2)1%鹽酸酒精分化20 s，自來(lái)水沖洗1 min；伊紅染色3 min，自來(lái)水沖洗1 min；伊紅染色3 min，自來(lái)水沖洗1 min；(3)經(jīng)梯度酒精脫水(70%～80%、90%～95%、100%)各3 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各5 min；中性樹(shù)膠封片；(4)普通光鏡下觀察組織病理學(xué)變化：光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核為藍(lán)色，胞漿為紅色。

檢測(cè)方法：采用二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)法行免疫組化染色，光鏡觀察，并應(yīng)用圖片分析軟件Image—Pro Plus 6.0 進(jìn)行光密度分析，用平均光密度值表示所測(cè)AngⅡ、 AT1R 及CD40L蛋白的表達(dá)情況，光密度值與蛋白含量成正比。用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5進(jìn)行RT-PCR法檢測(cè)RNA的濃度值，用灰度比值表示所測(cè)AngⅡ、 AT1R 及CD40L的基因表達(dá)情況,灰度值與基因表達(dá)量增長(zhǎng)趨勢(shì)相反。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

光鏡下，腦出血未治療組在尾狀核大片壞死區(qū)內(nèi)有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)細(xì)胞輕中度水腫，72 h病變達(dá)高峰；腦出血治療組在各時(shí)間點(diǎn)尾狀核壞死區(qū)域相對(duì)縮小，神經(jīng)細(xì)胞輕度水腫。見(jiàn)圖1～3。

2.2 免疫組化結(jié)果

腦出血后，大鼠腦組織中AngⅡ、CD40L及AT1R的平均光密度值從24 h開(kāi)始升高，72 h平均光密度值最高，即各炎癥因子的蛋白表達(dá)量在24 h最低，72 h最高。治療組各時(shí)間點(diǎn)AngⅡ、AT1R、CD40L的平均光密度值均較未治療組低，且與未治組比較相同炎癥因子在各時(shí)間點(diǎn)平均光密度值差異均有顯著性意義，P均<0.05，見(jiàn)表1。

2.3 RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果

腦出血后，大鼠腦組織中AngⅡ、CD40L、AT1R在24 h灰度比值最高，之后數(shù)值漸下降，72 h最低，即各炎癥因子的基因表達(dá)量在24 h最低，72 h最高。治療組各時(shí)間點(diǎn)AngⅡ、 AT1R 、CD40L的灰度比值均較未治療組低，且與未治組比較相同炎癥因子在各時(shí)間點(diǎn)灰度比值差異均有顯著性意義，P均<0.05，見(jiàn)表2。

圖1 2組大鼠24 h病灶側(cè)HE染色(×400)

圖2 2組大鼠48 h腦組織HE染色(×400)

圖3 2組大鼠72 h腦組織HE染色(×400)

表1 AngⅡ,AT1R和CD40L在2組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的平均光密度值

24h治療組未治組48h治療組未治組72h治療組未治組AngⅡ0．040±0．0021)0．055±0．0010．047±0．0041)0．067±0．0030．065±0．0021)0．092±0．011AT1R0．033±0．0051)0．058±0．0040．052±0．0021)0．063±0．0010．073±0．0121)0．099±0．004CD40L0．145±0．0051)0．158±0．0060．161±0．0021)0．170±0．0020．172±0．0031)0．208±0．004

1)與未治組比較，P<0.05

表2 AngⅡ,AT1R和CD40L在2組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的灰度比值

24h治療組未治組48h治療組未治組72h治療組未治組AngⅡ0．787±0．0111)0．886±0．0500．679±0．0041)0．797±0．0030．610±0．0081)0．719±0．004AT1R0．856±0．0211)1．083±0．0280．699±0．0361)0．865±0．0180．630±0．0161)0．766±0．047CD40L1．050±0．0251)1．152±0．0240．893±0．0241)1．096±0．0160．807±0．0331)0．962±0．035

1)與未治組比較，P<0.05

2.4 RNA濃度值測(cè)定結(jié)果

與未治組比較，治療組所測(cè)RNA濃度在24 h最低，之后漸升高，72 h濃度值最高， 2組間比較差異有顯著性意義，P<0.05。見(jiàn)表3。

表3 RNA濃度在2組間的比較

治療組未治組24h0．865±0．0121)1．034±0．01848h1．024±0．0241)1．162±0．02572h1．181±0．0291)1．290±0．006

1) 與未治組比較，P<0.05

3 討 論

腦出血是一種發(fā)病率很高的急性腦血管病，與同等體積的腦梗死相比，其死亡率和致殘率均較高。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腦出血后存在炎癥反應(yīng)，且較非出血性腦損傷更為明顯[12-13]。腦出血后細(xì)胞因子的主要來(lái)源是被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞[14]。小膠質(zhì)細(xì)胞等被激活后產(chǎn)生并釋放TNF-α，CD40是TNF-α受體超家族成員，在腦內(nèi)，主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞[15]和神經(jīng)元及神經(jīng)元樣細(xì)胞[16]，近來(lái)的流行病學(xué)資料顯示CD40L是可能和腦卒中相關(guān)的炎癥標(biāo)志物之一[17]。近來(lái)研究證實(shí)，在腦內(nèi)控制中樞和外周的交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)、調(diào)節(jié)水和鈉鹽的攝入及腦血流變化[18]的AngⅡ有促炎作用，能促進(jìn)經(jīng)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor related factors,TRAF)→2途徑的CD40L的炎癥反應(yīng)過(guò)程，使腦損傷加重。研究表明：用AT1R阻滯劑能抑制腦出血局部的白細(xì)胞浸潤(rùn)、膠質(zhì)細(xì)胞的激活和環(huán)氧化酶-2(COX2)表達(dá)，從而間接證實(shí)了AngⅡ與腦出血后的炎癥反應(yīng)有關(guān)[19]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示在腦出血后24 h血腫周圍腦組織出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞聚集及白細(xì)胞浸潤(rùn)，72 h炎癥反應(yīng)達(dá)高峰，且腦組織中AngⅡ、AT1R 及CD40L等炎癥因子的蛋白及基因表達(dá)也呈同樣的變化趨勢(shì)，都與腦水腫變化趨勢(shì)相同，表明腦出血后腦組織存在炎癥反應(yīng)，AngⅡ、AT1R 及CD40L均參與此反應(yīng)過(guò)程，且炎癥反應(yīng)和腦水腫形成關(guān)系密切；與未治療組比較，腦組織病變減輕，同時(shí)炎癥反應(yīng)也減輕，炎癥因子含量下調(diào)。在腦缺血實(shí)驗(yàn)中研究提示應(yīng)用小劑量AT1R拮抗劑可以通過(guò)與AT1R結(jié)合減輕炎癥反應(yīng)等途徑，產(chǎn)生腦保護(hù)作用，而對(duì)血壓無(wú)影響[20]。也就是說(shuō)在腦出血中應(yīng)用AT1R拮抗劑也可減輕腦組織病變，對(duì)神經(jīng)功能有保護(hù)作用。

希望這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果能廣泛應(yīng)用于臨床，使同時(shí)接受其他綜合治療的腦出血患者的神經(jīng)功能損傷進(jìn)一步減輕，以提高生活質(zhì)量，減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)。

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RoleofAT1Rantagonistsinthetreatmentofcerebralhemorrhageinrats

SUNYing-jing，NINGXian-zhong

(DepartmentofNeurology,theThirdAffiliatedHospitalofLiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121000，China)

ObjectiveDiscuss the nerve protective effect and mechanism of AT1R blocker in the treatment of cerebral hemorrhage in rats.MethodsThe ICH model induced via stereotaxic administration of collagenase type Ⅳ were 48,randomly divided into two groups， 24 of them were OLM(one kind of AT1R blocker)-treated ICH groups(referred to as treated groups hereinafter)， 24 of them were untreated ICH groups， at twenty-four hours, forty-eight hours and seventy-two hours after ICH model were induced， the pathological changes of brain tissue were observed with microscope after HE staining,the related indicators such as AngⅡ， AT1R and CD40L of brain tissue were tested by IHC method and RT-PCR method,and were expressed by the average optical density and the gray level ratio index， the RNA levels of brain tissue were measured by RT-PCR method,and were compared with each other at the same time.ResultsCompared with the untreated groups,the levels of AngⅡ, AT1R and CD40L were decreased,brain edema relieved, and each index numeric comparisons had statistical significance(P<0.05) in the treated groups.ConclusionThe levels of related inflammatory factors decreased after AT1R blocker combining with AT1R in the brain tissue of rats with intracerebral hemorrhage, so as to inflammatory reaction reduced and nerve protective effects were played.

cerebral hemorrhage; AT1R antagonists; immunohistochemical method; RT-PCR method

10.11724/jdmu.2013.03.07

R743.34

A

1671-7295(2013)03-0239-05

孫英晶，寧顯忠.血管緊張素Ⅱ-1型受體拮抗劑在腦出血大鼠治療中的作用[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,35(3)：239-243.

孫英晶(1975-)，女，遼寧大連人，副主任醫(yī)師。

寧顯忠，主任醫(yī)師。E-mail:ningxianzhong713@163.com

2013-03-25；

2013-05-08)