李志勤，王 菲，張 震，王 盟，黃建敏，李建生 ，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州450052 4)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州450052 5)鄭州大學(xué)生物工程系 鄭州450001 6)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州450052

#通訊作者，李建生，男，1955年10月生，博士，教授，研究方向:消化系統(tǒng)疾病的治療進(jìn)展，E-mail:lijiansheng@medmail.com.cn;張毅，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向:腫瘤免疫學(xué)、腫瘤干細(xì)胞和生物細(xì)胞治療，E-mail:yizhang@zzu.edu.com

丙型病毒性肝炎呈世界性分布，全球約有1.7億人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，60%～80%的HCV 感染者慢性化發(fā)展，30%的丙型病毒性肝炎可發(fā)展成為肝硬化、肝癌［1］。有效而持久的T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)是HCV 感染后病毒得以清除的重要決定因素［2］。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群。文獻(xiàn)［3-4］報(bào)道CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞參與了HBV、HIV 等多種病毒感染性疾病的發(fā)展過程。在HCV 感染所致的不同臨床轉(zhuǎn)歸中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞所起的作用尚不十分清楚。該研究以HCV 感染后不同臨床分型的患者為觀察對(duì)象，分析其外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分布比例的差異，探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞對(duì)于HCV 感染后疾病進(jìn)程的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2011年6月至2012年6月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科、消化內(nèi)科門診及住院部就診的59例HCV 感染者。其中慢性丙型肝炎患者35例，男16例，女19例，年齡19～65(42.1±8.4)歲;丙型肝炎肝硬化患者14例，男10例，女4例，年齡42～58(40.1±6.2)歲;HCV 感染后痊愈者10例，男5例，女5例，年齡8～46(36.1±5.3)歲。慢性丙型肝炎患者HCV-IgG、HCV RNA 均陽(yáng)性;丙型肝炎肝硬化患者均有典型的影像學(xué)資料支持診斷;HCV 感染后痊愈者指多次復(fù)查均為HCVIgG 陽(yáng)性，HCV RNA 陰性的感染者，均有應(yīng)用血制品史、手術(shù)史等。病例診斷均符合2004年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病和寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合制訂的丙型肝炎防治指南［5］。所有患者抗-HCV 陽(yáng)性，而甲型、乙型、丁型、戊型肝炎病毒感染血清標(biāo)志物陰性、排除HIV 感染以及乙醇性肝病等。另選年齡和性別與患者相匹配的健康志愿者33例作為健康對(duì)照，男17例，女16例，年齡25～47(38.1±8.2)歲。對(duì)照標(biāo)本由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心提供。

1.2 外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分布比例的檢測(cè) CD4-FITC、CD25-PE、FOXP3-APC 抗體及同型對(duì)照IgG2α-FITC 和IgG2α-PE、IgG2α-APC 購(gòu)自德國(guó)美天旎公司;Buffer 購(gòu)自美國(guó)Biolegend 公司;淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)。BD Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD 公司產(chǎn)品)，DIVA軟件(BD 公司)用于獲取和分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所有受試者在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下自肘靜脈留取5 mL 外周靜脈血，肝素鈉抗凝，采用梯度-密度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。將分離得到的單個(gè)核細(xì)胞加入CD4-FITC 抗體、CD25-PE 抗體(同型對(duì)照用IgG2α-FITC 和IgG2α-PE)各5 μL，振蕩均勻，避光孵育20 min。將破膜劑按照1:1 000 的比例稀釋后分別加入存放細(xì)胞的EP 管內(nèi)，避光孵育5 min，1 500 r/min 離心5 min，棄上清。加入FOXP3-APC 抗體及同型對(duì)照，振蕩均勻后，避光孵育20 min，加入雙蒸水，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至上樣管內(nèi)，應(yīng)用BD Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 HCV RNA 載量檢測(cè) HCV RNA 載量采用熒光定量PCR 法［6］檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，檢測(cè)下限為500 IU/mL。操作嚴(yán)格按照試劑盒和儀器說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0 對(duì)于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。4組間外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分布比例比較行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，慢性HCV 感染者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分布與HCV RNA 載量相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分布比例比較 見表1。

表1 不同臨床類型的HCV 感染及健康者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分布比較 %

2.2 慢性HCV 感染者外周血CD4CD25調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分布與HCV RNA 載量相關(guān)性分析 慢性丙型肝炎及丙型肝炎肝硬化患者HCV RNA 載量分別為(6.07±1.07)IU/mL 和(5.71±1.10)IU/mL，外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分布比例與HCV RNA 載量呈正相關(guān)(r =0.780 和0.870，P =0.021和0.015)。

3 討論

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的主要作用是抑制T 細(xì)胞增殖及維持自身免疫耐受。有研究［6-7］表明，多種病原體的慢性感染都能夠誘導(dǎo)宿主外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，去除CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞能夠顯著降低這些病原體的感染。于建武等［8］研究表明，伴隨胰島素抵抗的慢性丙型肝炎患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分布比例隨著胰島素抵抗的加重而降低。也有研究［9］表明CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞細(xì)胞在非乙醇性脂肪肝炎患者的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，可抑制免疫功能，造成該類型患者低度炎癥反應(yīng)及免疫功能紊亂。

作者檢測(cè)了HCV 感染后不同臨床類型患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的分布，發(fā)現(xiàn)HCV感染后痊愈的感染者與健康對(duì)照者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分布比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而丙型肝炎肝硬化組高于慢性丙型肝炎組，提示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞可能是HCV 感染慢性化進(jìn)展的重要影響因素之一。將HCV 感染慢性化慢性丙型肝炎患者及丙型肝炎肝硬化的患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分布比例及HCV RNA載量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)2 者呈明顯的正相關(guān)，推測(cè)患者病毒復(fù)制招募了大量CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，抑制CTL 細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致機(jī)體對(duì)于HCV 感染產(chǎn)生免疫耐受，HCV 感染難以清除，病情遷延不愈，甚至發(fā)展至丙型肝炎肝硬化。

總之，研究CD4CD25調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在丙型肝炎病程中所發(fā)揮的作用將有助于進(jìn)一步了解丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制，為丙型肝炎的免疫治療提供新的思路。

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