陳 玉，陸舍銘 ，朱 麗，孟昭宇，丁中濤

1紅塔煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，玉溪653100;2云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院分析化學(xué)，昆明650091

杭白菊(Hangzhou white chrysanthemum)，又名杭菊、甘菊、茶菊，是“浙八味”之一，素有“西湖龍井，杭白貢菊”之美譽(yù)。杭白菊既可食用、制作飲品，又是重要的中藥材。《神農(nóng)本草經(jīng)》曾記載:菊花“久服利血?dú)?，輕身，耐老延年”。研究表明，杭白菊提取物中含有的姜黃烯、棕櫚酸等物質(zhì)可增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力，降低血液中脂肪和膽固醇含量，具有改善心肌營(yíng)養(yǎng)、抗炎、清除活性氧自由基等藥理作用［1，2］;富含的酯類(lèi)、烯類(lèi)等使其具有獨(dú)特的菊花香氣，用于卷煙中能夠改善和修飾卷煙煙氣，有提高卷煙香氣質(zhì)量、改善余味、柔和煙氣的作用，賦予煙絲一種自然風(fēng)味［3-6］。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的分析平臺(tái)，由于其卓越的多功能性、高選擇性，在早期的復(fù)雜樣品成分分析中廣泛應(yīng)用。飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOFMS)較傳統(tǒng)質(zhì)譜具有靈敏度好、分析速度快、無(wú)需掃描等優(yōu)勢(shì)，且能推測(cè)分子和碎片離子的元素組成以輔助解譜，定性功能大大提高［7］。TOF MS 發(fā)展以來(lái)，已有不少前人應(yīng)用于藥物、天然產(chǎn)物等復(fù)雜樣品的分析中，并以更快速、準(zhǔn)確及可靠的特點(diǎn)得到肯定。

本實(shí)驗(yàn)采用GC-TOFMS 聯(lián)用技術(shù)，以丙酸苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，根據(jù)內(nèi)標(biāo)物和杭白菊浸劑中揮發(fā)性化學(xué)成分的相對(duì)峰面積進(jìn)行定量，分離效果良好，操作簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確度高。實(shí)驗(yàn)分析測(cè)定了杭白菊浸劑中揮發(fā)性化學(xué)成分33 種，利用飛行時(shí)間質(zhì)譜所提供的具有精確質(zhì)量特征碎片離子峰并參考譜圖檢索結(jié)果，確認(rèn)了DL-蘋(píng)果酸二乙酯的分子結(jié)構(gòu)，并提出了裂解機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和裝置

GC-TOFMS 聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司Agilent 7890/美國(guó)Waters 公司GCT Premier);NIST 檢索庫(kù)(NIST MS Search 2.0);KQ-700DB 數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 主要材料和試劑

杭白菊浸劑樣品(由紅塔煙草集團(tuán)提供，編號(hào)91428);二氯甲烷(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司);無(wú)水硫酸鈉(化學(xué)純，汕頭市達(dá)濠精細(xì)化工品公司);丙酸苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)品(日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 內(nèi)標(biāo)萃取液的配制

選用丙酸苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。準(zhǔn)確稱(chēng)取丙酸苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)品0.1007 g，用二氯甲烷定容至100 mL作為內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，該儲(chǔ)備液再以二氯甲烷稀釋成10.07 μg/mL 丙酸苯乙酯的內(nèi)標(biāo)萃取液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)量杭白菊浸劑樣品1.0 g 于錐形瓶中，加入二氯甲烷內(nèi)標(biāo)萃取液10 mL 及1.0 g 無(wú)水硫酸鈉，于超聲儀中超聲30 min;靜置5 min 后取上層清液，用0.45 μm 氣相濾膜過(guò)濾取樣于Agilent 氣相色譜瓶中，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

1.3.3 儀器分析條件

氣相條件:色譜柱:HP-5MS 毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 mm × 0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:220 °C;載氣:高純He;進(jìn)樣量:1 (L;恒流模式;不分流;升溫程序:起始溫度50 °C，停留2 min，以每分鐘5 °C 的升溫速率升至220 °C 保持15 min。

TOFMS 條件:離子源:EI;電子能力:70 eV;離子源溫度:220 °C;Trap 電流:100 μA;質(zhì)量數(shù)范圍:45～400 (m/z);溶劑延遲:0～6 min;采集時(shí)顯示的譜圖:總離子流色譜圖(TIC);用全氟三丁基胺作內(nèi)標(biāo)，在m/z:218.9856 處作單點(diǎn)鎖定校正精確質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

杭白菊浸劑樣品經(jīng)由GC-TOFMS 檢測(cè)所得的總離子流圖見(jiàn)圖1;共分離出58 個(gè)峰，通過(guò)正反匹配度大于80 為依據(jù)，鑒定出33 個(gè)化學(xué)成分，并根據(jù)內(nèi)標(biāo)物和杭白菊浸劑中揮發(fā)性化學(xué)成分的相對(duì)峰面積，對(duì)各成分進(jìn)行了定量。詳情見(jiàn)表1。

圖1 杭白菊浸膏GC-TOFMS 總離子圖Fig.1 GC-TOFMS total ion chromatogram of Hangzhou white chrysanthemum extract

表1 杭白菊浸劑GC-TOFMS 分析結(jié)果匯總Table 1 Compounds identified in Hangzhou white Chrysanthemum extract by GC-TOFMS

苯乙酮(Acetophenone) C8H80 120.0573 16.137 84 17.5 2，2，4-trimethyl-1-cyclohex-3-enecarboxaldehyde C10H16O 152.1197 18.249 87 7.8 4H-Pyran-4-one，2，3-dihydro-3，5-dihydroxy-6-methyl－ C6H8O4 144.0420 18.52 89 82.1丁二酸單乙酯(Butanedioic acid，1-ethyl ester) C6H10O4 146.0576 19.269 97 60.2琥珀酸二乙酯(Diethyl succinate) C8H14O4 174.0888 19.357 87 68.7辛酸乙酯(Ethyl caprylate) C10H20O2 172.1458 19.848 95 28.4 5-羥甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural) C6H6O3 126.0315 21 93 179.5苯乙酸乙酯(Ethyl phenylacetate) C10H12O2 164.0834 21.396 87 7.7 DL-蘋(píng)果酸二乙酯(Ethyl malate) C8H14O5 190.0837 21.983 95 231.6 DL-蘋(píng)果酸(Malic acid) C4H6O5 134.0213 22.467 92 33.9芳-姜黃烯(Ar-curcumene) C15H22 202.1716 27.865 89 4.7 α-柏木烯(alpha-Cedrene) C15H14 194.1092 28.43 85 7.3(E)-1，1-二乙氧基-4-甲基-2-戊烯((E)-1，1-diethoxy-4-methyl-pent-2-ene) C10H20O2 172.1458 30.044 95 10.1金合歡醇(Farnesol) C15H26O 222.1977 32.486 92 76.1桉油烯醇(Espatulenol) C15H24O 220.1821 33.784 89 47.6安息香酸芐酯(Benzyl benzoate) C14H12O2 212.0834 34.665 92 16.2鄰苯二甲酸二異丁酯(Diisobutyl phthalate) C16H22O4 278.1512 36.66 95 53.3棕櫚酸(Palmitic acid) C16H32O2 256.2394 38.64 89 111.5棕櫚酸乙酯(Ethyl palmitate) C18H36O2 284.2706 39.432 82 163.1 Benzoic acid，2-［(4-oxo-4H-1-benzopyran-2-yl)methyl］－ C17H12O4 280.0732 43.936 91 29.8亞油酸乙酯(Ethyl linoleate) C20H36O2 308.2706 45.022 94 200.74亞麻酸乙酯(Ethyl linolenate) C20H34O2 306.2550 45.315 90 201.24

由表1 可以看出，杭白菊浸劑中揮發(fā)性化學(xué)成分主要是酯類(lèi)、帖烯和倍半帖烯類(lèi)、醛類(lèi)和高級(jí)脂肪酸，主要成分有:DL-蘋(píng)果酸及DL-蘋(píng)果酸二乙酯、亞麻酸乙酯、亞麻酸酸乙酯、糠醛及5-羥甲基糠醛、棕櫚酸、棕櫚酸乙酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、丁二酸單乙酯、琥珀酸二乙酯、金合歡醇，占杭白菊浸劑揮發(fā)性化學(xué)成分的75%。

這些物質(zhì)是構(gòu)成杭白菊香味的重要物質(zhì)，使其具有甜香香氣、水果香氣、煙草香氣等香味特征［4］。其中亞油酸、亞麻酸等高級(jí)脂肪酸能改變煙氣粗劣，使其具有淡甜柔和的吸味;酯類(lèi)具有香脂氣息和水果香味，可提高和改善煙香味、減輕刺激性;帖烯和倍半帖烯能夠改進(jìn)和提高煙草的自然風(fēng)味，具有香味增效的作用［5］。還有很多物質(zhì)具有一定的藥理作用，如:蘋(píng)果酸及其酯類(lèi)衍生物具有特殊愉快的酸味，有較好的抗氧化能力，是良好的鉀補(bǔ)充藥，它能保持人體水分平衡，治療水腫、高血壓和脂肪積聚癥等;姜黃烯具有清除自由基作用;安息香酸芐酯、桉油烯醇具有平喘、去痰作用;棕櫚酸具有特殊的香味和滋味，有降低血清膽固醇的作用［6］;5-羥甲基糠醛具有抗氧化、保護(hù)肝組織、改善血液微循環(huán)等生物活性［8］等等。

2.2 分析討論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了相關(guān)杭白菊成分分析的文獻(xiàn)中未報(bào)道過(guò)的新物質(zhì)DL-蘋(píng)果酸二乙酯。在本實(shí)驗(yàn)總離子圖的21.98 min 出現(xiàn)了精確質(zhì)量為117.0562 的基峰，檢索結(jié)果為DL-蘋(píng)果酸二乙酯，匹配度為95。21.98 min 的色譜峰經(jīng)掃描后得到飛行時(shí)間質(zhì)譜圖，DL-蘋(píng)果酸二乙酯的色譜圖及質(zhì)譜圖如下圖2。

圖2 DL-蘋(píng)果酸二乙酯的色譜圖及質(zhì)譜圖Fig.2 Chromatogram and mass spectrum of ethyl malate

對(duì)以上質(zhì)譜圖中m/z 117.0562 的基峰進(jìn)行單元素分析，對(duì)應(yīng)的元素組成分別為C5H9O3、C9H9，理論質(zhì)量分別為m/z 117.0552、117.0704，以絕對(duì)誤差最小為標(biāo)準(zhǔn)，選擇與理論值(117.0552)的絕對(duì)誤差僅1.0 mDa 的C5H9O3，這恰與DL-蘋(píng)果酸二乙酯的特征離子相同。對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行全元素分析，以絕對(duì)誤差小于6 mDa 來(lái)篩選分析結(jié)果，得到如下表2 質(zhì)譜碎片離子的飛行時(shí)間質(zhì)譜數(shù)據(jù)。觀察表2 中5 個(gè)具有精確質(zhì)量的特征碎片離子峰，精確質(zhì)量的絕對(duì)誤差均在±3 mDa 以?xún)?nèi)，這樣的精確質(zhì)量所對(duì)應(yīng)的分子組成具有很高的可信度［7］。

表2 DL-蘋(píng)果酸二乙酯的飛行時(shí)間質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 2 TOFMS data of ethyl malate

DL-蘋(píng)果酸二乙酯的裂解機(jī)理見(jiàn)圖3。在70 eV電離條件下，DL-蘋(píng)果酸二乙酯分子主要裂解成5 個(gè)特征碎片離子(表2)，具體裂解途徑為:該分子在m/z 190.0828 處沒(méi)有出現(xiàn)明顯的分子離子峰，M 失去乙氧基得到陽(yáng)離子a(m/z 145.0507，C6H9O4)，a失去羰基后生成自由基b(m/z 118. 0610，C5H10O3)。b 失去質(zhì)子得到豐度為100%的陽(yáng)離子c(m/z 117.0562， C5H9O3)，c 緊接著失去C2H4經(jīng)過(guò)麥?zhǔn)街嘏诺玫疥?yáng)離子d(m/z 89.0248，C3H5O3)，d 失去一個(gè)水分子經(jīng)過(guò)重排，得到一個(gè)有明顯質(zhì)譜峰、較穩(wěn)定的共軛體系陽(yáng)離子e(m/z 71.0143，C3H3O2)。根據(jù)表2 的飛行時(shí)間質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及提出的裂解機(jī)理，能很好的確認(rèn)DL-蘋(píng)果酸二乙酯分子結(jié)構(gòu)。根據(jù)與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)相對(duì)峰面積的方法，DL-蘋(píng)果酸二乙酯含量為231.6 μg/g，占杭白菊浸劑揮發(fā)性化學(xué)成分的11.85%。

圖3 DL-蘋(píng)果酸二乙酯的飛行時(shí)間質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 TOFMS fragmentation pathway of ethyl malate

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用GC-TOFMS 聯(lián)用技術(shù)，根據(jù)TOFMS提供的分子離子峰和特征碎片離子峰，參考譜圖檢索結(jié)果確認(rèn)化合物的分子結(jié)構(gòu)。以丙酸苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分離效果良好，依據(jù)內(nèi)標(biāo)物和杭白菊浸劑中揮發(fā)性化學(xué)成分的相對(duì)峰面積進(jìn)行定量。測(cè)定了杭白菊浸劑中揮發(fā)性化學(xué)成分33 種，并對(duì)DL-蘋(píng)果酸二乙酯的定性過(guò)程進(jìn)行分析討論，提出了裂解途徑，確定其分子結(jié)構(gòu)。

綜上所述，采用TOFMS 進(jìn)行定性，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高，適合天然產(chǎn)物等復(fù)雜樣品的成分分析和檢測(cè)，在未來(lái)更深入的研究中有廣闊的應(yīng)用前景。

1 Jiang HD(蔣惠媂)，Xia Q(夏強(qiáng))，Xu WH(徐萬(wàn)紅)，et al.Chrysanthemum morifolium Ramat cardiovascular pharmacological effect and mechanism research progress. World Sci Technol Mod Tradit Chin Med (世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化)，2002，4(2):31-33.

2 Zhang QH(張清華)，Zhang L(張玲).Research advance in chemical composition and pharmacological action of chrysanthemum.Food Drug (食品與藥物)，2007，9(2):60-63.

3 Yan KY(閆克玉)，Yu J(于靜)，Wang B(王冰). Extraction of essential oil in Hangzhou white chrysanthemum and its application in cigarette. Tobacco Sci Tech (煙草科技)，2008，1:34-42.

4 Xu Y(許永)，Xiang NJ(向能軍)，Gao Q(高茜)，et al.Analysis of pyrolysis products of Hangzhou white chrysanthemum extract by gas chromatography-mass spectrometry. Fine Chem (精細(xì)化工)，2008，25:766-770.

5 Xu Y(許永)，Xiang NJ(向能軍)，Shen HL(沈宏林)，et al.Analysis of volatile components of Hangzhou white chrysanthemum extract and applications in cigarette.Chin J Spectrosc Lab (光譜實(shí)驗(yàn)室)，2008，25:167-172.

6 Sun GJ(孫桂菊)，Zhang FF(張菲菲)，Ma YJ(馬永建)，et al.Composition analysis of volatile oil extracted from chrysanthemum moriflium Ramat and determination of β -elemene.Food Sci (食品科學(xué))，2008，29:506-510.

7 Hou KY(侯可勇)，Dong C(董璨)，Wang JD(王俊德)，et al.New developments and applications in time-of-flight mass spectrometer.Prog Chem (化學(xué)進(jìn)展)，2007，19:385-392.

8 Lei P(雷鵬)，Li Y(李媛)，Li XZ(李新中)，et al.Comparison of gallic acid and 5-hydroxymethyl furfural between traditional slice decoction and dispensing granule decoction of Siwu Tang.Tradit Chin Drug Res Clin Pharmacol (中藥新藥與臨床藥理)，2009，20:468-470.

9 Zhang GS(張國(guó)升)，Li QR(李前榮)，Yi H(尹浩)，et al.Rapid determination of ferulic acid and identification of its structure in rhizome of phragmites communis by GC-TOFMS.Chin Tradit Herb Drugs (中草藥)，2005，36:333-335.

10 Sun XM(孫秀梅)，Zhang JX(張紀(jì)秀)，Zhang Q(張青)，et al. Characterization of phytohormones methoxime and TMS derivatives by gas chromatography time-of-flight mass spectrometry.J Chin Mass Spectrom Soc (質(zhì)譜學(xué)報(bào))，2009，30:110-113.