崔朝初，王建剛* ，段冷昕，錢 昕，王彩娥，徐新麗

1河南科技大學醫(yī)學院藥理學與醫(yī)學分子生物學重點實驗室;2 河南科技大學第一附屬醫(yī)院，洛陽471003

中國傳統(tǒng)中藥材壁虎(天龍)具有抑菌、抗腫瘤、抗驚厥及溶血的功效。大量的基礎(chǔ)實驗和臨床研究證實，在多種惡性腫瘤中壁虎可通過升高bax等基因的表達誘導凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用［1］。本課題組前期研究成果也顯示壁虎干粉能抑制腫瘤細胞的生長并誘導其凋亡［2，3］。有文獻報道壁虎可以用于治療晚期喉癌［4］，但機制尚未明確。本文通過對壁虎干粉進一步提取分離，得到壁虎乙醇提取物(GEE)并對其在喉癌細胞Hep2 中誘導凋亡的作用進行了研究。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

壁虎(Gekko japonicus ，光明飲片加工廠有限公司);胰酶(Sigma 公司);RPMI-1640 干粉(Gibco 公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma 公司);Hoechst 33258(Sigma 公司);一抗β-actin，一抗caspase-3，一抗VEGF，辣根過氧化物酶標記二抗(Santa Cruz 公司);阿霉素(ADR，浙江海正藥業(yè)有限公司);PVDF膜(PALL 公司)。

1.2 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(Sanyo 公司);超凈工作臺SP2DJ22B 型(金壇市榮華儀器制造有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司);ELx800 酶標儀(美國伯騰儀器有限公司);膠體磨(上海諾尼輕工機械有限公司);冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);熒光顯微鏡(Olympus 公司);96 孔、6孔細胞培養(yǎng)板(Costar 公司)，Mini trans-blot 電轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad 公司)。

1.3 細胞株

人喉癌Hep2 細胞株由中國藥科大學惠贈，用含10%胎牛血清的1640 完全培養(yǎng)液于37 ℃恒溫，5% CO2，95%飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞進行實驗。

2 實驗方法

2.1 GEE 的制備

取100 g 干壁虎粉與400 mL 雙蒸水混勻置于膠體磨中勻漿，然后4 ℃離心取沉淀。將所得沉淀溶于400 mL 一定濃度的乙醇溶液中后置于4 ℃冰箱。每0.5 h 攪勻一次，4 h 后離心取上清。減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，冷凍干燥得到7.2 g 金黃色固體，稱之為壁虎乙醇提取物(GEE)，貯存于-20 ℃冰箱備用。

2.2 MTT 法測定細胞活性

分別將GEE 干粉溶于含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液，使GEE 濃度分別為125、150、200、250、300、400、500 μg/mL 備用。將處于對數(shù)生長期的Hep2 細胞以每孔1 ×104個接種于96 孔板，每孔200 μL。過夜培養(yǎng)后棄上清，將配置好的不同濃度(125、150、200、250、300、400、500 μg/mL)的GEE 溶液分別加入培養(yǎng)板并設(shè)置空白對照組(只加含10%胎牛血清的1640 完全培養(yǎng)液)，每孔200 μL，分別培養(yǎng)24、48、72 h。結(jié)束前4 h 每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，每孔加二甲基亞砜(DMSO)200 μL，避光輕微振蕩10 min。于酶標儀490 nm 波長處測定各孔的吸光度A，并按下式計算抑制率:抑制率(%)=［1-(A實驗組/A陰性對照)］×100%，實驗重復3 次。

2.3 Hoechst 33258 熒光染色法觀察Hep2 細胞的形態(tài)學改變

將處于對數(shù)生長期的Hep2 細胞以2 ×105/孔接種于鋪有蓋玻片的6 孔板中，用不同濃度(100、200、250 μg/mL)的GEE 及0.5 μg/mL ADR 分別處理48 h，并設(shè)置陰性對照組(CONTROL)。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，細胞爬片用PBS 洗滌三次，于10 μg/mL的Hoechst 33258 染色液中避光孵育10 min，取出細胞爬片用PBS 洗滌3 次，于熒光顯微鏡下觀察。

2.4 Western blot 法檢測caspase-3、VEGF 蛋白的表達

將處于對數(shù)生長期的Hep2 細胞以2 ×105/孔接種于6 孔板，分別用ADR(0.5 μg/mL)和不同劑量的GEE(100、200、300 μg/mL)處理并設(shè)置陰性對照組(CONTROL)。培養(yǎng)48 h 后，棄上清，每孔分別加入100 μL 蛋白裂解液裂解，在冰浴下靜置裂解10 min，收集蛋白并定量。95 ℃加熱5 min 后，每組分別取等量蛋白上樣，進行SDS-PAGE 電泳。電泳結(jié)束后取出凝膠，于4 ℃下250 mA 電流轉(zhuǎn)印150 min 至PVDF 膜，脫脂奶粉封閉1 h 后，分別加入一抗β-actin、caspase-3、VEGF 于37 ℃孵育1 h，加二抗，于37 ℃孵育1 h，DAB 顯色。

2.5 統(tǒng)計分析

3 實驗結(jié)果

3.1 GEE 對Hep2 增殖的抑制作用

MTT 結(jié)果(圖1)顯示125、150、200、250、300、400、500 μg/mL 的GEE 在不同程度上均能抑制Hep2 細胞的增殖，其抑制作用隨濃度增加、時間的延長而加強，呈劑量和時間依賴性。GEE 作用24、48、72 h 后 其IC50值分 別為336. 858、237. 949、188.991 μg/mL。

圖1 GEE 對Hep2 細胞增殖的抑制作用Fig.1 The anti-proliferative effect of GEE on Hep2 cells

3.2 Hep2 細胞的形態(tài)學改變

Hoechst 33258 熒光染色后，由圖2 可知，未經(jīng)藥物處理的CONTROL 組(A 組)，細胞呈彌漫性均勻熒光，且熒光較弱。在各用藥組中，Hep2 細胞在形態(tài)學上發(fā)生明顯改變，核固縮呈致密的顆粒狀強熒光，尤其是GEE 高劑量組(E 組)出現(xiàn)凋亡的典型形態(tài)學變化，可見清晰的凋亡小體。

圖2 GEE 誘導Hep2 細胞發(fā)生的形態(tài)學改變Fig.2 The morphological changes of Hep2 cells treated with GEE

3.3 GEE 對Hep2 中caspase-3、VEGF 蛋白表達的影響

如圖3 所示，隨著GEE 濃度的增加，caspase-3蛋白的表達明顯升高，VEGF 蛋白表達明顯降低，表現(xiàn)為劑量依賴性。ADR、GEEH、GEEM、GEEL 各組與control 相比均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。

圖3 GEE 對Hep2 細胞中caspase-3、VEGF 蛋白含量表達的影響Fig.3 The protein expression of caspase-3，VEGF in Hep2 cells treated with GEE

4 討論

目前對于腫瘤的治療，臨床上主要采用以化療為主的綜合性治療。常規(guī)化療藥有嚴重的毒副反應及耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，使其應用和療效受到了限制，因此開發(fā)無毒副作用的天然藥物治療腫瘤已成為眾多研究者的焦點［5］。傳統(tǒng)中藥壁虎的抗腫瘤作用已經(jīng)得到證實，但研究的并不深入，其有效成分和作用機制尚未闡明，在Hep2 細胞中的抗腫瘤作用研究較少。本文研究了GEE 組分在人喉癌hep2 細胞中誘導凋亡的作用。結(jié)果顯示GEE 對Hep2 細胞增殖有抑制作用且能使其發(fā)生典型的凋亡形態(tài)學變化。125～500 μg/mL 的GEE 在作用24、48、72 h 后IC50值分別為336.858、237.949、188.991 μg/mL。

細胞增殖過度和細胞凋亡異常是腫瘤發(fā)生的生物學基礎(chǔ)。因此，如何調(diào)控凋亡相關(guān)基因或其產(chǎn)物，誘導細胞進入凋亡是腫瘤治療取得成功的關(guān)鍵［6］。Caspase-3 是細胞凋亡過程中的主要效應因子，大多數(shù)觸發(fā)細胞凋亡的因素，最終均需要通過激活caspase-3，進而通過裂解包括procaspase 2、6、7、9，以及Bcl-2、PARP (poly ADP-ribose polymerase)，ICAD (inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease)，gelsolin 和fodrin 等組分誘導細胞凋亡［7］。有研究證實，caspase-3 基因的突變和缺失可增加腫瘤發(fā)生的幾率［8］。本研究結(jié)果顯示，隨著GEE 劑量的增加，caspase-3 蛋白表達逐漸增多，提示GEE 可劑量依賴性調(diào)控caspase-3 蛋白的表達，誘導Hep2 細胞的凋亡。

VEGF 是促進內(nèi)皮細胞生長的特異性有絲分裂原，可增加轉(zhuǎn)錄潛能，還具有增加血管通透性的效應。VEGF 與其受體結(jié)合后可釋放多種因子，促進血管內(nèi)皮細胞分裂增殖，從而為腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。此外，抑制VEGF 蛋白的表達還可引起線粒體色素C 的釋放及caspase-3 蛋白表達的增加，進而誘導凋亡的發(fā)生［9］。目前，在眾多惡性腫瘤中VEGF 已成為重要的治療靶點［10］。本研究結(jié)果表明，隨著GEE 劑量的增大，VEGF 蛋白表達減少。

綜上所述，GEE 組分可能通過上調(diào)caspase-3 和抑制VEGF 蛋白的表達而誘導Hep2 細胞的凋亡。但GEE 成分復雜，究竟是何種物質(zhì)發(fā)揮作用及其機制有待進一步的研究。

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3 Liu F(劉菲)，Wang SY(王淑英)，Li Y(李艷)，et al.The inhibition effect of dry geckko in esophagus cancer cells and s180 bearing mice. J Chin Med Mater(中藥材)，2008，31:1304-1307.

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