侯兆君, 張 明, 蔣富清, 張寶玉

(1. 天津科技大學, 天津 300457; 2. 安徽省肥西縣城建環(huán)保局, 安徽 肥西 231200; 3. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071)

海底沉積物和上部洋殼構成了海底深部生物圈, 蘊藏著豐富的物種資源。海底深部生物圈微生物的研究已成為21世紀海洋領域地學和生物學綜合研究的一個生長點, 顯示出旺盛的生命力和發(fā)展應用前景。

海底深部生物圈為極端環(huán)境, 是嗜冷、嗜熱、嗜壓、嗜酸、嗜堿、嗜鹽或嗜低營養(yǎng)等極端環(huán)境微生物的理想來源。由于不同的生長特性, 傳統(tǒng)的菌種鑒定方法很難進行。即使參照傳統(tǒng)方法對一些深海細菌進行鑒定, 其結果也并非與手冊中描述相符合, 往往存在一定差異[1-3]?；蛘哂行┘毦诓煌囵B(yǎng)條件下形態(tài)多變, 甚至在同一培養(yǎng)條件下菌落形態(tài)也不穩(wěn)定。 因此迫切需要建立一些簡單、方便、易于操作的鑒定方法對深海微生物進行分析, 為深海微生物資源的開發(fā)利用奠定基礎。

目前16S rRNA基因無論在高等生物, 還是在原核生物鑒定中的應用證實其已成為屬間、種間分類研究中最常用也是最有效的分子指標, 被廣泛地應用于各種微生物的遺傳特性和分子差異的研究[4], 同時國際上也建立了多個微生物16S rRNA序列數(shù)據(jù)庫, 成為對微生物鑒定分類非常有用的參照系統(tǒng)。通過對未知微生物16S rRNA基因序列的測定和比較分析, 可以快速有效地對其進行鑒定。

作者從西菲律賓海底4 954 m深的沉積物中分離到一批細菌, 其最適生長溫度均低于37℃。本文結合生理、電鏡及分子生物學方法即應用16S rRNA基因作為分子指標對這些細菌進行分類鑒定, 并對其系統(tǒng)進化情況進行了分析。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

菌株B2, B5, B6(暫定名)分離自水深4 954 m處的深海海泥中。2216E培養(yǎng)基: 酵母膏0.1%, 蛋白胨0.5 %, Fe4(PO4)30.005% , 瓊脂1.5%, 加入過濾后的自然海水配制, pH 7.2～ 8.0。

1.2 菌株的分離與形態(tài)觀察

首先用無菌刀片將冰凍的泥樣上層削去, 用酒精燈灼燒該刀片, 冷卻后用刀尖取少許泥樣于無菌液體培養(yǎng)基, 上述培養(yǎng)液在4℃培養(yǎng)7～10 d, 轉接相應的固體培養(yǎng)基, 培養(yǎng)觀察是否有菌落生成, 菌落形態(tài)用光學顯微鏡和KYKY2008B掃描電鏡觀察。

1.3 菌株的最適生長條件測定

1.3.1 耐鹽性與需鹽性

測定方法參照常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[5]。

1.3.2 最適生長溫度的測定

單菌于17℃±1℃左右培養(yǎng)至指數(shù)生長期, 然后接種于10 mL 2216E培養(yǎng)基中, 在6、10 15、20、28、37℃等溫度下培養(yǎng)48 h, 取菌液測吸光度A600。并繪制溫度-生長曲線。

1.3.3 最適初始pH測定

于2216E液體培養(yǎng)基中15℃培養(yǎng)至指數(shù)生長期, 然后接種于不同起始pH(pH6～14)的10 mL液體培養(yǎng)基中。150 r/min, 15℃恒溫培養(yǎng)12 h, 取菌液測其吸光度A600。并繪制pH-生長曲線。

1.4 細菌DNA的制備

采用細菌單菌落直接PCR擴增法, 參照文獻[4]制備細菌DNA。即取一單菌落溶于10μLSDS(1%)溶液中, 充分振蕩搖勻, 用300 μL TE溶解獲得DNA原液。將原液按一定的梯度稀釋作為PCR擴增模板。

1.5 16S rDNA的PCR擴增及克隆

采用細菌通用引物8F: 5′-AGAGTTTGATCCT- GGCTCAG-3′1492R: 5′-GTTACCTTGTTACGACTT- 3′。50 μL擴增反應體系含有: 50 mmol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3), 1.5 mmol/LMgCl2, 細菌DNA模板約10 ng, 1.5 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTPs, 0.2 μmol/L引物, 0.3 U/μL Taq DNAase。 每次均設陰性對照, PCR反應條件如下: 96℃變性4 min, 94℃變性30 s, 59℃退火45 s, 72℃延伸1 min, 10個循環(huán)后, 94℃變性30 s, 54℃退火45 s, 72℃延伸1 min, 最后是72℃延伸10 min。在Ependdorf Mastercycler Gradient基因擴增儀上完成。擴增產物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 用凝膠成像系統(tǒng)Pharmacia Biotech ImageMaster VDS記錄實驗結果。

切膠回收純化約1.5 kb目的DNA片段。用T4DNA連接酶將純化的片斷與pMD18-T vector載體 (購自Takara)連接, 然后熱激轉化Escherichia coliDH 5α感受態(tài)細胞。以氨芐青霉素(100 mg/L)抗性和藍白斑篩選陽性轉化子。菌液經PCR檢測為含目的片斷的陽性轉化菌后, 交由上海博亞生物技術有限公司進行測序。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育學關系分析

序列的多重排列用BioEdit 中的Clastal W 程序完成, 轉換至phylip 3.6, Bootstrap value 設為1 000, 得到的樹文件用Treeview 3.2輸出。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與形態(tài)觀察

根據(jù)上述方法獲得3株菌, 根據(jù)采集位置的不同暫命名為B2、B5與B6。B2菌為橙黃色圓形不透明菌落; B5為鮮紅色的圓形菌落; B6為乳白色圓形不透明菌落。菌落見圖1。各菌株的掃描電鏡照片見圖2。從SEM照片上可以看出, B2和B6菌均為桿狀細菌, 但B6菌的外面覆有鞘膜。B5菌為球形。

2.2 菌株最適生長溫度、鹽度及pH

2.2.1 最適溫度

溫度測試表明, 3株菌在4℃均能生長, 但3株菌株最適溫度分別約為20、28、28℃, B2菌20℃開始出現(xiàn)渾濁, 溫度超過28℃生長開始緩慢(圖3)。

2.2.2 最適鹽度

觀察結果表明B2在鹽度3%～10%生長良好; B5和B6菌在鹽度3%～7%能夠生長, 鹽度10%不生長。

圖1 3株菌菌落形態(tài)圖片 Fig. 1 Optical images of 3 strains of deep-sea bacteria

圖2 3株深海菌的電子掃描照片 Fig. 2 SEM images of 3 strains of deep-sea bacteria

2.2.3 最適pH

pH測試表明, B2菌在pH 8時生長良好, pH超過8, 生長明顯緩慢; B5菌也在pH 8生長良好, pH超過10, 生長明顯緩慢; B6菌在pH 12下生長的最好, pH超過13, 生長明顯緩慢(圖4)。

圖3 溫度對3株菌生長的影響 Fig. 3 Changes of bacteria density at different temperature

圖4 pH對3株菌生長的影響 Fig. 4 Changes of bacteria density at different pH

2.3 菌株16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析[6]

采用上述引物, B2菌16S rDNA的PCR產物共獲得1 406個堿基, B5為1 414個; B6 為 1 399 個。上述序列已提交到GenBank, 獲得的序列號分別是: AY822610; DQ513408; DQ407272。

B2菌16S rDNA的序列同源性分析表明, 它與GenBank中Bacillus菌(Acession number : AF221855、AY690690、BSP315068、BSP244686、BSP391199等)有高達99%的同源性(表1), 而這些細菌分別是海洋桿狀細菌或海洋土壤桿狀細菌, 另外, 在系統(tǒng)進化樹(圖5)上的聚類分析也表明, B2菌與海洋桿狀細菌或海洋土壤桿狀細菌的親緣關系也最近, 因此該菌應該屬于海洋桿狀細菌。

B5菌16S rDNA的序列同源性分析表明, 它與GenBank中Arthrobacter菌(Acession number: AF479354、AF511518、AY131225、AY576708、DQ177488等)有高達99%的同源性(表1), 而這些細菌屬于Arthrobacter菌, 均為從冰凍土壤或深海中分離出來的細菌, 為海洋土壤中常見菌。另外, 系統(tǒng)進化樹(圖 5)上的聚類分析也表明, B5菌與Arthrobacter菌屬細菌的親緣關系也最近, 因此該菌應該屬于Arthrobacter菌屬。

B6菌的16S rDNA的序列同源性分析表明, 它與GenBank中Acinetobacter菌(Acession number : AF188300、AF324537、AF468386、AY055373、AY994049、DQ088799等)有高達99%的同源性(表1), 而這些細菌是從深海中分離出來的Acinetobacter johnsonii, 另外, 在系統(tǒng)進化樹(圖5)上的聚類分析也表明, B6菌與這些細菌的親緣關系也最近, 因此該菌應該屬于Acinetobacter johnsonii。

一般認為16S rRNA 序列同源性小于98%, 可以認為屬于不同的種, 同源性小于93%～95%, 可以認為屬于不同的屬[7-8]。綜上所述, 本文研究的3株細菌應該分別屬于芽孢桿菌(Bacillus)、節(jié)桿菌(Arthrobacter)、蛋白菌(Acinetobacter)3個不同的菌屬, 這3個菌屬為從深海中分離出來的能夠培養(yǎng)的常見菌屬[9-11]。

3 討論

由于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法的局限以及海底深部生物圈生境的特殊性, 能夠培養(yǎng)的微生物數(shù)量非常有限, 常常低于總細胞計數(shù)的1%[12]。為克服傳統(tǒng)培養(yǎng)法的局限, 16S rRNA基因序列和系統(tǒng)進化分析近年來得以廣泛應用。分子技術研究表明, 海底深部生物圈不但蘊藏了豐富的微生物種類, 并且許多種類與目前已描述的所有細菌和古菌都相距甚遠, 代表著新穎的微生物物種或類群。

表1 深海微生物16S rDNA基因序列比對結果 Tab. 1 The BLAST results of 3 strains of deep-sea bacteria

圖5 根據(jù)16S rDNA序列構建的深海細菌系統(tǒng)進化樹 Fig. 5 Phylogenetic tree of deep-sea bacteria with 16S rDNA sequences by NJ method L11703 (Thermonema lapsum) is outgroup

海底4 954 m 基本上是一個無光、高鹽等極性環(huán)境。我們獲得的菌株從生長溫度及對光的需求方面來看, 加上我們嚴格的無菌操作, 應該確定所獲得的菌株是深海細菌。

按照最適生長溫度和生長上限溫度的不同, 深海細菌一般被分為2大類: 嗜冷型(psychrophilic)和耐冷型 (psychrotrophic 或 psychrotolerant)。其中, 嗜冷菌通常是指最適生長溫度≤15℃, 生長上限溫度＜20℃的菌株; 耐冷菌則是指能夠在4℃左右良好生長、但最適生長溫度＞20℃的微生物[13]。根據(jù)該規(guī)定, 我們所獲得的3株菌應該屬于耐冷菌范疇。

傳統(tǒng)的菌種鑒定是選用不同的代謝底物作為碳源和氮源, 將菌株利用碳、氮源的能力作為鑒定指標, 該方法建立在37℃菌株能夠正常生長的前提之上。而深海微生物的最適生長溫度或者低于37℃, 或者高于37℃, 也就是說在37℃無法正常生長或根本無法生長。因此作者在參照常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊對其進行鑒定時, 往往無法獲得理想結果。因此, 無法參照常規(guī)方法對其進行鑒定分類。通過16S rRNA基因序列同源性比較并結合系統(tǒng)發(fā)育分析, 往往能夠對極端微生物進行快速、準確的初步分類, 并且這一方法已廣泛應用于極端環(huán)境下細菌的鑒定, 都取得了較好的結果[14-16]。

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