夏忠芳， 王智楠△， 樂(lè)建新， 徐忠強(qiáng)， 崔 瓏

1武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心耳鼻咽喉科，武漢 430016

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉科，武漢 430022

近年來(lái)研究表明先天免疫系統(tǒng)中Toll樣受體（toll－like receptors，TLRs）在抗原識(shí)別和先天免疫中發(fā)揮重要作用，機(jī)體多種細(xì)胞能表達(dá)TLRs，尤其是參與機(jī)體第一道防線的細(xì)胞［1］；其家族中TLR9因子能識(shí)別外源性微生物CPG 基序及內(nèi)源性有害物質(zhì)的刺激［2］。作為呼吸道的第一道防線，鼻竇腔如何運(yùn)用機(jī)體的免疫過(guò)程來(lái)抵御吸入空氣中的病原體，慢性鼻－鼻竇炎中鼻竇黏膜中是否存在先天的免疫應(yīng)答異常，目前尚未見(jiàn)廣泛研究。本研究通過(guò)免疫組化及免疫熒光共聚焦方法，觀察6～12歲慢性鼻－鼻竇炎鼻黏膜組織中TLR9因子的表達(dá)及變化，分析先天性免疫在兒童慢性鼻－鼻竇炎發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

①病變組：根據(jù)EPOS關(guān)于慢性鼻－鼻竇炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］選擇病例：病史≥12 周；病變?cè)诒乔火つぜ爸辽俨?個(gè)竇腔；必須具備以下至少2項(xiàng)癥狀：鼻塞和／或鼻漏（前／后鼻孔）、面部疼痛／壓迫感或嗅覺(jué)減退／消失；CT 顯示鼻竇和／或竇口復(fù)合體的黏膜改變；鼻內(nèi)鏡下中鼻道和／或鼻竇內(nèi)有膿性分泌物和／或黏膜水腫阻礙竇口復(fù)合體。選擇武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心及武漢市協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉科2008年～2012年符合上述標(biāo)準(zhǔn)的慢性鼻－鼻竇炎共12例患兒。這12例患兒未合并鼻息肉；變應(yīng)原皮試陰性；均行鼻竇內(nèi)窺鏡檢查及在病情穩(wěn)定期行mini－FESS術(shù)，術(shù)前不使用藥物。

②正常組：隨機(jī)選擇12 例未罹患慢性鼻－鼻竇炎的單純腺樣體肥大的兒童，并行腺樣體切除術(shù)的患兒。

1.2 取材及方法

1.2.1 取材 12例病變組患兒在全麻下行mini－FESS手術(shù)過(guò)程中，取病變的黏膜組織及下鼻甲部分黏膜進(jìn)行比較。12例正常組在行腺樣體切除手術(shù)過(guò)程中，在術(shù)前征得家長(zhǎng)同意的情況下，于下鼻甲取小部分黏膜（約0.2cm×0.2cm×0.2cm）。每份標(biāo)本分成2 份，1 份行生物素免疫組化，1 份行FITC免疫熒光組化。

1.2.2 免疫組化及免疫熒光共聚焦顯微鏡操作步驟 使用的所有試劑均為分析純，單克隆羊抗人TLR9抗體、生物素抗羊二抗、帶熒光標(biāo)記FITC 抗羊二抗均采購(gòu)于ICN Biomedicals公司（美國(guó)），無(wú)菌塑料制品采購(gòu)于NUNC公司（丹麥）。

取下的標(biāo)本用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，按免疫組化及免疫熒光的的技術(shù)要求操作。病變組及對(duì)照組的標(biāo)本中均設(shè)陰性對(duì)照，即標(biāo)本中不加入一抗（單克隆羊抗人TLR9抗體），其余步驟均一致。

將石蠟切片厚5μm，每份標(biāo)本分別常規(guī)脫蠟，3%H2O2去離子水孵育10～30min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；蒸餾水沖洗，PBS 浸泡5 min；室溫血清封閉15～30 min；滴加1∶400的羊抗人TLR9抗體一抗，4℃過(guò)夜。次日PBS（pH7.5）沖洗，3min×5次；滴加生物素標(biāo)記的1∶200 抗羊二抗，37℃孵育30 min，PBS 沖洗，3 min×5 次；37℃孵育30 min，PBS沖洗，3min×5次。DAB 顯色5 min，自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。Olympus顯微鏡下觀察并照相，TLR9陽(yáng)性表達(dá)為棕褐色。

免疫熒光檢測(cè)時(shí)，加一抗過(guò)夜后，第2天在暗室中加入FITC標(biāo)記的1∶200抗羊二抗，DAPI染色，緩沖甘油封片。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有熒光后，置入共聚焦顯微鏡下觀察，F(xiàn)ITC 激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，采集圖像，使用IPP 軟件測(cè)量陽(yáng)性顆粒的吸光度值，分析TLR9的表達(dá)量。TLR9陽(yáng)性表達(dá)為綠色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正常組和病變組標(biāo)本的吸光度平均值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩者間的差異性比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常組及病變組的免疫組化和免疫熒光的表達(dá)情況

在正常組的鼻黏膜中發(fā)現(xiàn)有TLR9 陽(yáng)性顆粒的表達(dá)，從標(biāo)本中看出TLR9的表達(dá)主要分布在黏膜下層及腺體周?chē)▓D1A、B），在慢性鼻－鼻竇炎的標(biāo)本中也發(fā)現(xiàn)有TLR9陽(yáng)性顆粒的表達(dá)，分布在腺體周?chē)▓D1C）。TLR9陰性表達(dá)見(jiàn)圖1D。

共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)正常鼻黏膜組織中TLR9的表達(dá)也位于黏膜下層（圖2A）及腺體周?chē)▓D2B），慢性鼻－鼻竇炎標(biāo)本中TLR9 的表達(dá)位于腺管周?chē)▓D2C）。

圖1 正常組及慢性鼻－鼻竇炎鼻黏膜TLR9表達(dá)（免疫組化）Fig.1 The expression of TLR9in chronic rhinosinusitis and normal nasal mucosa tissues（immunohistochemistry）

2.2 正常組及病變組TLR9陽(yáng)性顆粒吸光度值比較

使用IPP軟件測(cè)量12例病變組與12例正常組標(biāo)本中TLR9陽(yáng)性顆粒的吸光度值，并進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：慢性鼻－鼻竇炎組的吸光度平均值為（105.3±30.8），正常組為（214.9±57.5），P ＜0.05，提示TLR9在慢性鼻－鼻竇炎標(biāo)本中的吸光度值是下降的，與正常鼻黏膜組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 正常組及慢性鼻－鼻竇炎鼻黏膜TLR9表達(dá)（免疫熒光共聚焦顯微鏡）Fig.2 The expression of TLR9in chronic rhinosinusitis and normal nasal mucosa tissues（immunofluorescence confocal microscopy）

3 討論

目前認(rèn)識(shí)到慢性鼻－鼻竇炎的發(fā)病與很多因素有關(guān)，但確切的發(fā)病機(jī)制現(xiàn)仍未完全清楚。慢性鼻－鼻竇炎的病理基礎(chǔ)是炎性改變，主要表現(xiàn)為黏膜水腫，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，導(dǎo)致竇口狹窄和引流通道受阻［4］。在透射電鏡下，可見(jiàn)慢性鼻－鼻竇炎的鼻黏膜細(xì)胞表面纖毛數(shù)減少，纖毛倒伏，胞質(zhì)內(nèi)有空泡形成［5］。目前很多學(xué)者傾向于：慢性鼻－鼻竇炎的發(fā)生是其免疫防御功能失調(diào)所致［6］；鼻腔作為機(jī)體與外界相通的門(mén)戶(hù)，存在著先天免疫防御系統(tǒng)，以應(yīng)對(duì)各種體內(nèi)外因素對(duì)機(jī)體的傷害［7］。然而先天免疫防御途徑最近才開(kāi)始受到關(guān)注，TLRs（toll－like－receptors）的發(fā)現(xiàn)使得對(duì)天然免疫防御機(jī)制的認(rèn)識(shí)達(dá)到了一個(gè)新的水平［8］，其中TLR9 是TLR 家族的重要成員，TLR9在介導(dǎo)外源CpG DNA 激活先天免疫過(guò)程中有重要的生物學(xué)意義［9］。

在成人慢性鼻－鼻竇炎的黏膜組織及細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有TLR9的表達(dá)［10－11］，在兒童慢性鼻－鼻竇炎黏膜上皮組織中情況如何？故我們選擇了12例慢性鼻－鼻竇炎患兒，12 例未罹患慢性鼻－鼻竇炎的單純腺樣體肥大的兒童作為研究對(duì)象，以期探究?jī)和员牵歉]炎黏膜上皮組織中TLR9的表達(dá)特點(diǎn)。

我們采用免疫組化及免疫熒光共聚焦的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)鼻黏膜組織中TLR9 蛋白的分布及特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常鼻黏膜和慢性鼻－鼻竇炎的標(biāo)本中確實(shí)存在著TLR9的表達(dá)，且主要集中在黏膜下組織及腺體周?chē)?，提示兒童的鼻黏膜組織中，存在著先天免疫防御反應(yīng)的基礎(chǔ)，推測(cè)可能TLR9因子參與或介導(dǎo)了該免疫應(yīng)答反應(yīng)。

兒童慢性鼻－鼻竇炎多為病毒及細(xì)菌感染后引起的炎癥性反應(yīng)［12］，TLR9含有未甲基化CpG 基序的微生物DNA 受體，能特異性識(shí)別外源細(xì)菌和病毒DNA 中的CpG 序列或人工合成的寡脫氧核苷酸（CpG—oligodeoxynucleotides，CpG－ODN），從而產(chǎn)生系列的免疫反應(yīng)［13］。共聚焦顯微鏡下TLR9在慢性鼻－鼻竇炎中是處于低表達(dá)水平的，提示兒童慢性鼻－鼻竇炎的發(fā)病與TLR9介導(dǎo)的先天免疫異常存在著一定的關(guān)聯(lián)，TLR9在該機(jī)制中可能扮演重要角色。

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