劉曉亮， 袁長(zhǎng)吉， 莊 平， 韓 薇， 趙 欣

1吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，長(zhǎng)春 130021

2廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院兒科，深圳 518052

3吉林大學(xué)第一醫(yī)院小兒呼吸二科，長(zhǎng)春 130021

綠茶的水溶性提取物含有多酚類(lèi)化合物兒茶素，兒茶素具有多種藥用功效［1］，其中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸（EGCG）是最主要的生物活性成分，也最具藥用功效。早已發(fā)現(xiàn)EGCG 具有抗腫瘤活性，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用［2－3］。本研究根據(jù)EGCG 對(duì)不同人口腔鱗癌細(xì)胞株增殖及信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，探討EGCG 的抗腫瘤的機(jī)制，為將EGCG 應(yīng)用于臨床腫瘤治療奠定基礎(chǔ)，并為EGCG的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

EGCG 購(gòu)于Sigma公司（E4143，≥95%）。將EGCG 溶解蒸餾水中，配置成濃度為5mg／mL的溶液。室溫下渦旋1min，37℃孵育1h。離心機(jī)5 000 r／min離心10 min，取上清去除未溶解的物質(zhì)，用0.22μm 的過(guò)濾器過(guò)濾上清以達(dá)到滅菌的目的，用培養(yǎng)液稀釋EGCG 至終濃度0～200μg／mL。

1.2 細(xì)胞系及培養(yǎng)

鱗癌細(xì)胞系CAL－27、SCC－25、KB 來(lái)自于美國(guó)Type Culture Collection （Manassas，VA）。CAL－27細(xì)胞系為人類(lèi)舌上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U／mL 青霉素／鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。KB細(xì)胞系為人類(lèi)口腔上皮癌細(xì)胞系，SCC－25細(xì)胞系為舌鱗狀上皮癌細(xì)胞系。KB 細(xì)胞和SCC－25細(xì)胞均培養(yǎng)于DMEM∶Ham’s F12＝1∶1的培養(yǎng)液中，其中含10%胎牛血清、100U／mL 青霉素／鏈霉素，37℃、5%CO2條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。每2～3天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)及篩選敏感細(xì)胞株

應(yīng)用MTT 方法測(cè)定EGCG 對(duì)鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分別種在96孔培養(yǎng)板中，密度為5×103／孔，5%CO2條件下培養(yǎng)24h后，分別給予不同濃度的EGCG （0、5、12.5、25、50、100、200μg／mL），每組均為3 個(gè)復(fù)孔，共培養(yǎng)72h。72h后每孔中加入8μL濃度為5mg／mL的MTT，孵育3h后棄孔內(nèi)上清液，加入100μL二甲基亞砜（DMSO）溶解結(jié)晶物，立即應(yīng)用酶標(biāo)儀ELx800 （Bio－Tek Instruments，Inc.，Winooski，VT）在波長(zhǎng)570nm 測(cè)定吸光度（A）值，以上實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，密度為5×105／孔，培養(yǎng)24h 后，加入不同濃度的EGCG（0、12.5、25、50μg／mL），共培養(yǎng)72h。PBS洗滌離心2 次，加入70%冷乙醇固定30 min，染色前用PBS離心沉淀去除固定液，加入200μL RNase，在37℃水浴30min再加入800μL碘化丙啶（PI）染色液混勻，于4℃避光30min，用FCM 進(jìn)行檢測(cè)并用其軟件分析結(jié)果。

1.5 Protein Pathway Array技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)

在直徑為10cm 的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞，密度至1×106／L。培養(yǎng)24h后加入50μg／mL 的EGCG，共孵育48h。48h后分別收集細(xì)胞，在4℃下1 000 r／min離心10 min，棄上清培養(yǎng)液，再用PBS 洗滌細(xì)胞2次，收集下層沉淀物。在沉淀的細(xì)胞中加入300μL 含有蛋白酶抑制劑（Roche Applied Science，Indianapolis，IN）的細(xì)胞裂解液（Cell Signaling Technology，Danvers，MA），裂解細(xì)胞3～5 min，超聲處理裂解物15s，共2 次，然后4℃下14 000r／min離心15 min。用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒（Pierce，Rockford，IL）測(cè)定蛋白濃度。把含300μg蛋白的細(xì)胞提取物加入到一個(gè)跨越全膠寬度的槽中，應(yīng)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)到硝基纖維素膜上，在5%的牛奶或3%BSA中室溫孵育1h，用帶有20個(gè)泳道的裝置（Bio－Rad，Hercules，CA）夾膜。在每個(gè)泳道中加入2 或3 種一抗，4℃過(guò)夜。洗膜后加入二抗，室溫孵育45 min。用ChemiDoc XRS系統(tǒng)顯像，掃描吸光度，不同吸光度值對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)水平。每種樣品以上實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2次。

1.6 蛋白印跡分析

應(yīng)用Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證Protein Pathway Array技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)變化。選擇CAL－27細(xì)胞系作為代表驗(yàn)證Cdk4、Cdk6、p－PDK1幾種蛋白的表達(dá)改變。在直徑為10cm 的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞，密度至1×106／L。培養(yǎng)24h后加入EGCG（濃度為0、5、12.5、25、50μg／mL），共孵育48h。48h后分別收集細(xì)胞，在4℃下1 000r／min 離心10 min，棄掉上清培養(yǎng)液，再用PBS洗滌細(xì)胞2次，收集下層沉淀物。按照上述方法提取蛋白，將20μg蛋白經(jīng)10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上。在硝基纖維素膜上加入Cdk4、Cdk6、p－PDK1（1∶1 000稀釋?zhuān)籗anta Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）的一抗，4℃過(guò)夜。洗膜后加入抗鼠的二抗，室溫孵育1h后應(yīng)用放射自顯影技術(shù)檢測(cè)蛋白發(fā)射信號(hào)，以β－actin（1∶10 000 稀釋?zhuān)琒igma）作為內(nèi)參照。

1.7 裸鼠移植瘤模型建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KB 細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化，吹打成單細(xì)胞懸液并離心，用無(wú)血清培養(yǎng)液離心洗滌1～2次，并計(jì)數(shù)，PBS調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×107個(gè)／mL。戴無(wú)菌手套，75%乙醇棉球消毒接種部位。用1mL注射器抽取瘤細(xì)胞懸液0.2 mL（含細(xì)胞2×106個(gè)），接種于裸鼠右側(cè)前肢肩背部皮下，共接種20只。每只接種1個(gè)點(diǎn)。接種后觀(guān)察并記錄腫瘤發(fā)生的時(shí)間。用精密游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的大小。

1.8 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組和處理方法

當(dāng)腫瘤長(zhǎng)至4～6mm 大小時(shí)，將成瘤裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為2組：對(duì)照組、EGCG 組，每組10只。EGCG 組：按25mg／kg灌胃，每日1次。對(duì)照組：等量生理鹽水灌胃，每日1次。連續(xù)給藥并觀(guān)察4周，每周測(cè)量裸鼠腫瘤最長(zhǎng)徑（a，mm）和與長(zhǎng)徑垂直的短徑（b，mm），以公式V（mm3）＝ab2／2計(jì)算腫瘤體積。4 周后處死裸鼠，剝?nèi)×鲶w并稱(chēng)重（W）。計(jì)算體積抑制率＝（1－V實(shí)驗(yàn)組／V對(duì)照組）×100%，質(zhì)量抑制率＝（1－W實(shí)驗(yàn)組／W對(duì)照組）×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有體外實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，Protein Pathway Array重復(fù)2次。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS 10.0，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用方差分析（ANOVA）對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG 對(duì)不同鱗癌細(xì)胞株的抑制作用

不同濃度的EGCG（0、5、12.5、25、50、100、200 μg／mL）對(duì)CAL－27、SCC－25、KB 細(xì)胞作用72h 的增殖抑制率見(jiàn)圖1。對(duì)CAL－27、KB、SCC－25的IC50值分別為59.0、102.5、102.5μg／mL。由此可見(jiàn)，EGCG 對(duì)3種類(lèi)型的人鱗癌細(xì)胞系均有抑制作用，并呈劑量依賴(lài)性，對(duì)CAL－27細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)，對(duì)SCC－25和KB細(xì)胞的抑制作用相似。

圖1 不同濃度的EGCG 對(duì)CAL－27、KB、SCC－25細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of EGCG of different concentrations on the growth of CAL－27，KB and SCC－25cells

2.2 EGCG 對(duì)CAL－27細(xì)胞周期的影響

由于CAL－27對(duì)EGCG 最為敏感，因此我們選擇了CAL－27 細(xì)胞進(jìn)一步研究了EGCG 對(duì)其在細(xì)胞周期方面的影響。CAL－27 細(xì)胞經(jīng)不同濃度EGCG（0、12.5、25、50μg／mL）作用72h后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)，細(xì)胞周期分析顯示，EGCG可以介導(dǎo)CAL－27 細(xì)胞S 期和G2／M 期阻滯，而G0／G1期細(xì)胞減少（與對(duì)照組相比，P＜0.05）（圖2和表1）。EGCG（50μg／mL）作用于CAL－27 細(xì)胞后，阻滯在S期的細(xì)胞升至10.67%，阻滯在G2／M期的細(xì)胞升至12.80%（圖2）。

圖2 EGCG 處理CAL－27細(xì)胞后的周期分布Fig.2 Effect of EGCG on the cell cycle distribution of CAL－27 cells

表1 不同濃度EGCG 處理CAL－27細(xì)胞后的周期分布Table 1 Effects of EGCG of different concentrations on the cell cycle distribution of CAL－27cells

2.3 EGCG 對(duì)CAL－27細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

應(yīng)用Protein Pathway Array技術(shù)分析EGCG對(duì)CAL－27細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響，共檢測(cè)107個(gè)磷酸化和非磷酸化蛋白，共有15種蛋白發(fā)生了明顯變化（圖3、4）。其中XIAP、Akt蛋白表達(dá)水平上調(diào)，p－ERK、p－PDK1、p－cdc2、p－RB、Cdk6、Cdk4、Cdk2、Cdc2P34、Cyclin D1、Cyclin E、cPKCα、PTEN、p53蛋白表達(dá)水平下調(diào)。Western blot確認(rèn)了以下結(jié)果：在CAL－27 細(xì)胞中EGCG 對(duì)p－PDK1、Cdk4、Cdk6的表達(dá)抑制是呈劑量依賴(lài)性的（圖5）。

圖3 應(yīng)用Pathway Array技術(shù)檢測(cè)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白表達(dá)示例圖Fig.3 Pathway Array showing the expression of the signaling－related proteins

圖4 EGCG（50μg／mL）處理CAL－27細(xì)胞48h后的蛋白表達(dá)變化Fig.4 Differential expression of proteins of CAL－27cells treated with 50μg／mL EGCG for 48h

圖5 應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)不同濃度EGCG 處理CAL－27細(xì)胞后Cdk6、Cdk4、p－PDK1的表達(dá)情況Fig.5 Western blot analysis of expression of Cdk6，Cdk4and p－PDK1in CAL－27cells treated with various concentrations of EGCG

2.4 EGCG 對(duì)裸鼠移植瘤的影響

EGCG 對(duì)移植瘤的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，見(jiàn)表2。

表2 EGCG 組、對(duì)照組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況比較（±s，n＝10）Table 2 Comparison of growth of tumor xenografts between EGCG and control groups（±s，n＝10）

表2 EGCG 組、對(duì)照組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況比較（±s，n＝10）Table 2 Comparison of growth of tumor xenografts between EGCG and control groups（±s，n＝10）

組別瘤體積（cm3）體積抑制率（%）瘤重（g）質(zhì)量抑制率（%5.259±0.457－2.992±0.240－EGCG 組對(duì)照組1.482±0.324 71.82 0.763±0.210 74.50

3 討論

傳統(tǒng)的化療藥物具有副作用大，患者依從性差等缺點(diǎn)，因而有必要研究開(kāi)發(fā)低毒而有效的抗癌藥物。茶多酚是從綠茶中提取出來(lái)的多酚類(lèi)化合物，其成分包括兒茶素、黃烷雙醇、黃酮類(lèi)和茶多酚酸類(lèi)，其中兒茶素是茶多酚的主要成分。EGCG 是兒茶素主要組成部分，亦是其最主要的活性成分［4］。大量的流行病學(xué)調(diào)查及體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)EGCG 對(duì)皮膚癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌等具有明顯的抗癌活性［5－7］，并且對(duì)正常的細(xì)胞無(wú)明顯的毒副作用。

Rieger－Christ等［8］的研究發(fā)現(xiàn)EGCG 在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，本研究結(jié)果顯示EGCG 在體外對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞有明顯的抑制作用，EGCG 對(duì)CAL－27、KB、SCC－25細(xì)胞的增殖均有抑制作用，并呈劑量依賴(lài)性，EGCG 對(duì)CAL－27細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)。本研究動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示EGCG 對(duì)口腔鱗癌移植瘤腫瘤的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)觀(guān)察EGCG 對(duì)細(xì)胞周期的影響，EGCG 可以介導(dǎo)CAL－27細(xì)胞周期S期和G2／M 期阻滯，G0／G1期細(xì)胞減少。雖然發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在亞－G1期也有輕度的增加（圖2），但影響凋亡仍不是EGCG 抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的主要機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EGCG 處理細(xì)胞并未導(dǎo)致前凋亡蛋白的表達(dá)上調(diào)也進(jìn)一步證實(shí)了這一觀(guān)點(diǎn)（圖4）。細(xì)胞周期與腫瘤發(fā)生之間存在密切的聯(lián)系，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的紊亂可導(dǎo)致細(xì)胞失控性增長(zhǎng)，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

應(yīng)用Protein Pathway Array技術(shù)分析蛋白表達(dá)顯示EGCG 可以激活許多信號(hào)傳導(dǎo)通路或?qū)е缕涞鞍妆磉_(dá)的變化，EGCG 主要影響CAL－27 的EGFR 和Notch 信號(hào)傳導(dǎo)通路。Notch、EGFR 信號(hào)通路是許多細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的交匯點(diǎn)，在細(xì)胞增殖、分化及凋亡中起著重要作用，不僅影響正常組織和細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育，而且和一些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。信號(hào)傳導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，EGCG 可以靶向多個(gè)細(xì)胞傳導(dǎo)通路途徑［9－11］，通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)致對(duì)CAL－27細(xì)胞株的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EGCG作用于CAL－27細(xì)胞系后，有多種蛋白表達(dá)水平發(fā)生改變（圖3、5），其中包括與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的蛋白、與細(xì)胞周期或細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白、腫瘤抑制基因、細(xì)胞凋亡抑制蛋白等，而且還有許多蛋白的磷酸化水平受到影響。Sadava等［12］研究發(fā)現(xiàn)EGCG 可以抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、Cdk4、Cdk6 的表達(dá)從而抑制細(xì)胞增殖，本研究中EGCG 導(dǎo)致p－PDK1、p－ERK、p－Cdc2、Cdk6、Cdk4、Cdk2、Cyclin E等與細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，而且Western blot確認(rèn)了EGCG 對(duì)p－PDK1、Cdk4、Cdk6的表達(dá)抑制是呈劑量依賴(lài)性的（圖5）。EGCG 也可導(dǎo)致一些與增殖相關(guān)的蛋白表達(dá)上調(diào)，例如Notch4 表達(dá)上調(diào)，分析原因可能是細(xì)胞通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變來(lái)對(duì)生長(zhǎng)抑制進(jìn)行代償。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EGCG 明顯抑制了CAL－27 細(xì)胞中ERK 的磷酸化，與Lu等［13］報(bào)道的關(guān)于致癌物（NNK）介導(dǎo)的鼠肺癌模型中EGCG 可以減少ERK 磷酸化的結(jié)果一致。EGCG 引起CAL－27 細(xì)胞周期蛋白水平的改變（Cdc2、Cdk6、Cdk4、Cdk2、Cyclin D1、Cyclin E）導(dǎo)致S 期和G2／M 期阻滯。EGCG 處理細(xì)胞后只有一種凋亡相關(guān)蛋白XIAP 發(fā)生改變，與細(xì)胞周期分析結(jié)果一致，提示抑制凋亡并非EGCG 抑制細(xì)胞增殖的主要途徑，EGCG 主要是通過(guò)改變細(xì)胞周期蛋白水平、抑制細(xì)胞增殖來(lái)發(fā)揮其抗癌效應(yīng)的。

綜上，EGCG 能夠抑制人口腔鱗癌細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的全面檢測(cè)及評(píng)價(jià)顯示EGCG對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)影響顯著。信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的改變是復(fù)雜的，不能用單一某種信號(hào)通路的改變來(lái)解釋EGCG 的作用。EGCG 作用于腫瘤細(xì)胞整體的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

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