楊 露，丁利君*，藍(lán)德安

(1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州市華琪生物科技有限公司，廣東 廣州 510220)

馬面魚，學(xué)名叫綠鰭?cǎi)R面鲀(Navodon septentionalis)，屬鲀形目單角鲀科馬面鲀屬魚類[1]。1994年韓陽(yáng)等[2]研究馬面魚油與魚肉對(duì)老年高血壓有明顯的降血壓作用，并無(wú)副作用。2000年陳丕茂等[3]分析了對(duì)綠鰭?cǎi)R面捕撈強(qiáng)度和開捕時(shí)間。2010年溫海深等[4]研究了綠鰭?cǎi)R面鲀的繁殖與發(fā)育情況，為其繁殖與養(yǎng)殖提供了科學(xué)依據(jù)。

市場(chǎng)上由馬面魚加工而成的魚糜、熟食、干制和罐頭等多種食品，日漸被大眾所接受和喜愛。魚骨中蛋白質(zhì)90%為膠原、骨膠原及軟骨素(酸性黏多糖)，有增強(qiáng)皮下細(xì)胞代謝，延緩衰老的作用[5]。利用生物工程得到活性的骨膠原多肽能夠促進(jìn)人體新陳代謝，具有健脾胃、改善睡眠、延緩衰老、預(yù)防骨質(zhì)疏松作用[5]。膠原多肽以相對(duì)分子質(zhì)量小[6]、易吸收、抗氧化活性強(qiáng)[7]等特點(diǎn)受到高度重視，在醫(yī)藥、化妝品、保健品和食品與飼料添加劑等方面有廣闊前景[8]。將生產(chǎn)加工而產(chǎn)生的大量馬面魚骨制成生物活性多肽，能實(shí)現(xiàn)“魚盡其用”，變廢為寶，變低值為高值，達(dá)到提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值、增加社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益的目的。

本實(shí)驗(yàn)主要探討用生物酶工程技術(shù)與響應(yīng)面法制備的馬面魚骨膠原多肽的基本理化特性及抗氧化功能性，為馬面魚骨的深入開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮馬面魚魚骨，由北海味萊鮮海洋生物科技有限公司提供。

風(fēng)味蛋白酶(酶活力3×104U/g) 廣州市華琪生物科技有限公司；L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 北京奇華盛生物技術(shù)發(fā)展中心；還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品 北京普博欣生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純級(jí)。

自動(dòng)凱式定氮分析儀 上海纖檢儀器有限公司；LGJ-12冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；Waters 510高效液相色譜 美國(guó)Waters公司；Ultraflex III型基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF) 德國(guó)Bruker公司。

1.2 馬面魚骨膠原多肽的制備工藝

馬面魚骨洗凈→粉碎→高壓蒸煮→磨漿→生物酶解→初濾去渣→微濾→超濾→冷凍干燥→馬面魚骨多肽粉

1.3 馬面魚骨基本成分分析

水分測(cè)定：參照GB/T 13101—1991《西式蒸煮、煙熏火腿衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》方法；灰分含量測(cè)定：參照GB/T 24872—2010《糧食檢驗(yàn) 小麥粉灰分含量測(cè)定》方法；總氮含量測(cè)定：凱氏定氮法；粗脂肪含量測(cè)定：GB/T 5512—1985《糧食、油料檢驗(yàn) 粗脂肪測(cè)定法》方法；水解度測(cè)定：游離氨基態(tài)氮甲醛快速滴定法[9]；氨基酸的測(cè)定：高效液相色譜分析法。

1.4 馬面魚骨多肽液的功能性檢測(cè)分析

1.4.1 紫外吸收檢測(cè)分析

吸取馬面魚骨粗膠原多肽液，加入蒸餾水，稀釋10倍。以蒸餾水作參比，采用UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)從波長(zhǎng)190～400nm掃描，測(cè)定最大吸收峰[10]。

1.4.2 氨基酸組成分析

樣品液中游離氨基酸組成采用高效液相色譜HPLC分析，總氨基酸組成參照劉艷[11]、Morre[12]等的方法將樣品液酸解后采用HPLC分析。氨基酸色譜檢測(cè)條件：PICO.TAG氨基酸分析柱，溫度38℃，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。

1.4.3 質(zhì)譜分析

采用MALDI-TOF質(zhì)譜法。將樣品配制到一定的質(zhì)量濃度與基質(zhì)α-4-氰羥肉桂酸(HCCA)混合均勻，點(diǎn)樣，用質(zhì)譜儀進(jìn)行分子質(zhì)量檢測(cè)[13]。

1.5 抗氧化功能分析方法

1.5.1 還原力的測(cè)定方法

參考張強(qiáng)[14]、曹煒[15]等的方法測(cè)定膠原多肽的還原能力。

1.5.2 清除·OH的測(cè)定方法

參考張璟等[16]的方法測(cè)定對(duì)·OH的清除率。

1.5.3 清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的測(cè)定方法

參考Xie Zhengjun等[17]的方法，分析魚骨膠原多肽對(duì)DPPH自由基的清除效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬面魚骨粉的基本成分分析

表 1 馬面魚骨粉的基本成分Table 1 Proximate analysis of N. septentionalis bone

新鮮馬面魚骨中水分達(dá)到70.83%，將其脫水干燥，制得馬面魚骨干粉。由表1可知，馬面魚骨干粉的蛋白質(zhì)含量高達(dá)53.71%，灰分含量高達(dá)39.79%。馬面魚骨屬于軟骨類，其中含有豐富的軟骨素及膠原蛋白質(zhì)，適宜應(yīng)用到化妝品類產(chǎn)品的開發(fā)與研制。

2.2 馬面魚骨膠原多肽粉的氨基酸分析

表 2 馬面魚骨粗膠原多肽的氨基酸成分Table 2 Amino acid composition of collagen from N. ptentionalis bone

采用高效液相色譜分析方法，分析馬面魚骨酶解、分離、干燥后制備的膠原多肽粉的氨基酸組成。由表2可知，馬面魚骨膠原多肽粉中總氨基酸含量達(dá)到77.42%，亞氨基酸中的羥脯氨酸和脯氨酸占總氨基酸成分的含量分別為2.66%和6.50%，馬面魚骨多肽粉的氨基酸組成與豬皮、牦牛骨[18]膠原多肽的氨基酸組成相似。馬面魚骨膠原多肽中還含有豐富的甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、賴氨酸，攝入此類多肽，能夠保證氨基酸的營(yíng)養(yǎng)均衡，粗膠原多肽具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能。

2.3 馬面魚骨膠原多肽的紫外吸收光譜

圖 1 馬面魚骨膠原多肽的紫外吸收光譜圖Fig.1 UV absorption spectrum of collagen peptide from N. septentionalis bone

將馬面魚骨膠原多肽樣品，經(jīng)過UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)掃描，確定其最大吸收峰。圖1結(jié)果表明，其峰值在230nm左右，而在280nm處基本無(wú)吸收。這是因膠原蛋白只含有少量的芳香族氨基酸，而膠原蛋白被水解后得到的膠原肽鏈中含有的C—O、—COOH、CO—NH2都是生色基團(tuán)，可以在220nm附近產(chǎn)生大的光吸收。所提取的膠原蛋白的最大吸收波長(zhǎng)約220nm，這與曾少葵等[10]研究的羅非魚鱗膠原蛋白的吸收特征相一致，符合膠原蛋白的特征吸收。

2.4 馬面魚骨膠原多肽的質(zhì)譜分析結(jié)果

采用MALDI-TOF質(zhì)譜法測(cè)定樣品膠原蛋白多肽的分子質(zhì)量分布范圍，結(jié)果如圖2所示，膠原多肽的分子質(zhì)量分布在3kD以內(nèi)，集中于1～2kD。因此說明膠原多肽的酶解效果較好，并且與蔣哲等[19]的鯊魚皮膠原蛋白肽的分子質(zhì)量分布比較接近，此方法對(duì)多肽分子質(zhì)量的測(cè)定及分布具有指導(dǎo)意義。

圖 2 膠原蛋白多肽的質(zhì)譜分析圖Fig.2 Mass spectrum of collagen peptide from N. septentionalis bone

2.5 馬面魚骨酶解液的抗氧化結(jié)果

2.5.1 馬面魚骨多肽液的還原力

圖 3 魚骨多肽與谷胱甘肽的還原力比較Fig.3 Reducing power of collagen peptide from N. septentionalis bone and GSH

由圖3可知，隨著膠原多肽質(zhì)量濃度的增加，還原力不斷上升。在60mg/mL時(shí)，魚骨膠原多肽的還原力明顯低于谷胱甘肽；但隨著質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，還原力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過谷胱甘肽。從整體趨勢(shì)分析，吸光度越大，膠原多肽還原力越大；質(zhì)量濃度越高，還原力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)[20]。此多肽具有良好的抗氧化功能，通過增加使用量能超過99%純谷胱甘肽的抗氧化效果，具有明顯的開發(fā)價(jià)值。

2.5.2 馬面魚骨膠原多肽酶解液對(duì)·OH的清除作用

圖 4 魚骨多肽與谷胱甘肽對(duì)·OH的清除作用比較Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of collagen peptid from N. septentionalis bone in comparsion with that of GSH

由圖4可知，魚骨多肽在高質(zhì)量濃度條件下和谷胱甘肽相比，對(duì)·OH的清除作用強(qiáng)于谷胱甘肽。在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除作用隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，在20mg/mL后，清除作用基本穩(wěn)定。馬面魚骨在10mg/mL時(shí)呈微小的下降趨勢(shì)，可能是馬面魚骨多肽液顏色的干擾及少量的混濁所致。當(dāng)馬面魚骨膠原多肽的質(zhì)量濃度為25mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率達(dá)到95.98%。但從整體趨勢(shì)分析，馬面魚骨膠原多肽液清除·OH效果明顯，可針對(duì)性地應(yīng)用到具有·OH清除的食品及化妝品中。

2.5.3 馬面魚骨膠原多肽酶解液對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖 5 魚骨多肽液與谷胱甘肽對(duì)DPPH自由基的清除作用比較Fig.5 DPPH radical scavenging activity of collagen peptid from N. septentionalis bone in comparsion with that of GSH

由圖5可知，谷胱甘肽和馬面魚骨多肽液對(duì)DPPH自由基清除作用明顯。谷胱甘肽純度高，在2mg/mL時(shí)即具有96%的清除作用，而馬面魚骨多肽隨著質(zhì)量濃度的升高，清除作用呈現(xiàn)臺(tái)階式的上升。當(dāng)達(dá)到10mg/mL時(shí)的清除作用達(dá)85%，接近谷胱甘肽。馬面魚骨膠原多肽的質(zhì)量濃度為25mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到97.36%。從分析可知谷胱甘肽和魚骨多肽的IC50分別為1.04mg/mL和5.88mg/mL。初步的研究為進(jìn)一步的分離純化，降低使用量、增加清除作用，提供了良好的科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié) 論

通過以上的理化性質(zhì)分析，馬面魚骨的膠原多肽的氨基酸成分分析中羥脯氨酸含量占總氨基酸含量約為2.66%，膠原多肽的組成主要是分子質(zhì)量為1～3kD的混合物，并且具有很好的抗氧化活性。當(dāng)其質(zhì)量濃度為60mg/mL時(shí)，其抗氧化活性中的還原能力與谷胱甘肽相當(dāng)，當(dāng)馬面魚骨膠原多肽的質(zhì)量濃度為25mg/mL時(shí)對(duì)·OH的清除率和DPPH自由基的清除率分別達(dá)到95.98%和97.36%。馬面魚骨膠原多肽，由于其具有良好的抗氧化活性，可以作為功能食品、醫(yī)藥產(chǎn)品、化妝品的添加物。

馬面魚骨系列的研究還需要繼續(xù)更加深入地分析并分離出魚骨膠原多肽液中的具有較強(qiáng)的抗氧化功能的多肽片段，提高單位質(zhì)量濃度下的抗氧化作用，降低使用量，降低產(chǎn)品成本。目前在馬面魚骨的實(shí)際應(yīng)用和生產(chǎn)方面，仍有大量魚骨待合理的開發(fā)。

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