胥 莉，李 陽，劉學(xué)波*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

車前子(Semen Plantaginis Asiaticae)為多年生草本車前科植物車前(Plantago asiatica L.)或平車前(P. depressa Willd)的干燥成熟種子，具有藥蔬兼用、藥食同源之性，已被衛(wèi)生部列為可用于保健食品的原料[1]。車前子的主要化學(xué)成分有多糖、黃酮、環(huán)烯醚萜類、車前子酸以及一些揮發(fā)油類[2]。醫(yī)學(xué)研究證明車前子具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等功效[3-5]。

大量研究證明，體內(nèi)活性氧積累所造成的氧化應(yīng)激參與了許多慢性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程[6]?；钚匝豕艏?xì)胞造成蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化和核酸斷裂，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常功能，最終導(dǎo)致慢性疾病的發(fā)生[7]。研究證實(shí)，抗氧化物質(zhì)可通過捕獲和中和自由基、干預(yù)自由基作用的通路而抑制自由基對機(jī)體的傷害。天然抗氧化劑以其具有安全，高效和無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)而受到普遍關(guān)注。從植物中尋找天然抗氧化劑來干預(yù)氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生已成為當(dāng)前功能食品研究中的熱點(diǎn)。

已有研究發(fā)現(xiàn)，車前子提取物有較強(qiáng)的抗氧化功效[8-9]，是一種潛在的天然抗氧化劑，其中多糖類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)含量較高且具有明顯的生物活性。然而關(guān)于車前子中黃酮和多糖抗氧化性的全面評價和比較卻少有報道，二者在氧化應(yīng)激相關(guān)疾病干預(yù)方面的研究也十分有限。本實(shí)驗(yàn)對車前子中總黃酮和總多糖的抗氧化活性進(jìn)行探討，并以6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞死亡模型來初步研究車前子活性物質(zhì)在干預(yù)神經(jīng)退行性疾病方面的應(yīng)用，以期為車前子功效的探究和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

車前子，購自楊凌華仁堂大藥房，粉碎后入袋4℃保存。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

DMEM/F12培養(yǎng)基(含有10%的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素) 美國Hyclone公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 美國Sigma公司；2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ) 美國Sigma Aldrich Fluka公司；水溶性VE(Trolox) 美國Cayman化學(xué)試劑公司；三氯化鐵、鹽酸、濃硫酸、無水乙醇、無水甲醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；微量移液器 德國Eppendorf公司；SC-3610低速臺式離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；KQ3200E超聲波清洗機(jī) 蘇州昆山市超聲儀器有限公司；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Model680酶標(biāo)儀 美國伯樂公司；3110型細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 車前子總黃酮的提取

參照賁永光等[10]的方法并略作改動：準(zhǔn)確稱取10g車前子原料，加入250mL 40%乙醇，在50℃、超聲功率400W的條件下提取30min，提取液在3500r/min條件下離心10min，收集上清液，重復(fù)提取一次，合并上清液。減壓濃縮至約100mL，再用40%乙醇定容至150mL。

1.3.2 車前子總黃酮含量測定

以蘆丁為對照品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法[11]測定總黃酮含量。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.03g，40%乙醇定容至50mL，即得0.60g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0～1.2mL，加入40%乙醇定容至5mL，加50g/L的亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻后放置10min，加100g/L硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻后放置10min，加40g/L氫氧化鈉溶液4.0mL，再加40%乙醇定容至10mL，搖勻，放置15min。測定510nm波長處吸光度，以蘆丁溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 11.112x + 0.0017(R2 = 0.9992)。

實(shí)驗(yàn)組取總黃酮提取液0.5mL，加入40%乙醇定容至5mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法，得到實(shí)驗(yàn)組吸光度(A實(shí)驗(yàn))?？瞻捉M分別取樣品0.5mL，加入40%乙醇定容，測其510nm波長處吸光度(A空白)。則樣品的吸光度(A樣品)可用式(1)計(jì)算。

按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總黃酮提取液中總黃酮的含量，以蘆丁計(jì)。

式中：ρ為提取液中總黃酮含量/(mg/mL)；ρ1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的總黃酮含量/(mg/mL)；V1為提取液定容體積/mL；V2為顯色反應(yīng)測定時取樣體積/mL。

式中：Y為提取率/%；m為提取液中總黃酮質(zhì)量/mg；m2為車前子原料質(zhì)量/mg。

1.3.3 車前子多糖的提取

參照周超[12]的方法，水浸提法提取總多糖：準(zhǔn)確稱取10g車前子粉末，加入80%乙醇100mL，浸泡24h，間歇攪拌，3500r/min離心15min，沉淀于50℃烘箱干燥。干燥后的沉淀加入350mL蒸餾水，100℃水浴攪拌提取6h，3500r/min離心15min，上層清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至濾液原體積的一半，加無水乙醇至體積為60%，4℃醇沉6h，抽濾后用蒸餾水定容至150mL。

1.3.4 車前子總多糖含量的測定

采用苯酚硫酸法[12]測定總多糖含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖配制100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0～1.2mL，加入蒸餾水使其共2.0mL，再加入6%的苯酚液1.0mL，濃硫酸5.0mL，搖勻后放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出迅速冷卻至室溫，490nm波長處測定吸光度。以葡萄糖溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0065x－0.0229(R2 = 0.9932)。

實(shí)驗(yàn)組取0.0 1 m L 總多糖提取液，補(bǔ)加蒸餾水1.99mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法，得到吸光度(A實(shí)驗(yàn))?？瞻捉M取0.01mL總多糖提取液，加入7.99mL蒸餾水搖勻，在490nm波長處測定吸光度(A空白)。則樣品的吸光度(A樣品)可用式(4)計(jì)算。

按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總多糖提取液中總多糖的含量，以葡萄糖計(jì)。

式中：ρ為提取液總多糖含量/(mg/mL)；ρ1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的總多糖含量/(mg/mL)；V1為提取液定容體積/mL；V2為顯色反應(yīng)測定時取樣體積/mL。

式中：Y為多糖提取率/%；m為提取液中多糖質(zhì)量/mg；m2為車前子原料質(zhì)量/mg。

1.3.5 車前子提取物的抗氧化性

1.3.5.1 DPPH自由基的清除實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取10.01mg Trolox標(biāo)準(zhǔn)品，室溫下放置30min，用蒸餾水超聲波輔助溶解后，定容至200mL即為200μmol/L的Trolox溶液，稀釋得到Trolox標(biāo)準(zhǔn)梯度液。分別取1mL標(biāo)準(zhǔn)梯度液，加入4.5mL的DPPH甲醇溶液(取7.88mg的DPPH用無水甲醇定容至200mL，得100μmol/L的DPPH甲醇溶液)，充分混勻，避光靜置30min，波長517nm處測定其吸光度(A實(shí)驗(yàn))。

分別作空白組、對照組?？瞻捉M以水代替樣品(A空白)，對照組以甲醇代替DPPH甲醇溶液(A對照)。各組平行3次，按式(7)計(jì)算DPPH自由基清除率，并以Trolox濃度為橫坐標(biāo)/(μmol/L)，清除率為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為：y = 0.5083x－1.5032(R2 = 0.9993)。

取總黃酮提取液和總多糖提取液，稀釋成不同的質(zhì)量濃度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測定DPPH自由基的清除率。

1.3.5.2 鐵還原能力實(shí)驗(yàn)

將30mmol/L乙酸鈉-乙酸緩沖液、10mmol/L TPTZ溶液、20mmol/L FeCl3溶液按體積比10：1：1混合配制得到TPTZ工作液，分別吸取20～160μmol/L的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL與TPTZ工作液4.5mL，混勻后避光反應(yīng)30min，于593nm波長處測定其吸光度(A實(shí)驗(yàn))。

分別作空白組、對照組，空白組以水代替樣品(A空白)，對照組以水代替TPTZ工作液(A對照)。

以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，鐵還原力為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y = 0.0075x－0.012(R2 = 0.9998)。

將總黃酮提取液和總多糖提取液稀釋至適宜的質(zhì)量濃度，各取1mL樣品稀釋液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定樣品的鐵還原力。

1.3.5.3 ABTS+·的清除實(shí)驗(yàn)

將7mmol/L的ABTS溶液10mL和7.35mmol/L的K2S2O8溶液5mL混合后在室溫下避光放置16h形成ABTS儲備液，使用前用無水乙醇稀釋成工作液，使其在734nm波長處的吸光度為0.70±0.02。分別吸取1mL Trolox標(biāo)準(zhǔn)梯度液與ABTS工作液5mL混合均勻，室溫反應(yīng)5min，于734nm波長處測定其吸光度(A實(shí)驗(yàn))。

分別作空白組、對照組，空白組以水代替樣品(A空白)，對照組以無水乙醇代替ABTS工作液(A對照)，按式(9)計(jì)算清除率。

以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，ABTS+·清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=0.5212x–0.1775(R2=0.9991)。

取1mL不同稀釋倍數(shù)的總黃酮提取液和總多糖提取液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，計(jì)算對應(yīng)的清除率。

1.3.6 MTT實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 車前子提取液對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

消化收集細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個/mL，接種到96孔板中，每孔100μL，同時設(shè)置對照孔，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將2種車前子提取液用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基10倍和100倍稀釋，加入到96孔板中，每孔100μL，每組均設(shè)6復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后，用無血清培養(yǎng)基清洗培養(yǎng)孔1次，每孔加入10μL 5mg/mL MTT溶液和100μL無血清培養(yǎng)基，作用4h后，小心吸去培養(yǎng)基。每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)，置37℃搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀測量各孔在490nm的OD490nm值。按式(10)計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.6.2 車前子提取物對6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞死亡的影響

方法類似于1.3.6.1節(jié)，僅在2種提取液作用24h并清洗后，每孔加入100μL 6-OHDA溶液(終濃度200μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24h，之后進(jìn)行MTT溶液檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 車前子總黃酮和粗多糖的提取

經(jīng)計(jì)算，車前子總黃酮的提取率為1.54%，在實(shí)驗(yàn)所用的定容至150mL的總黃酮提取液中，總黃酮質(zhì)量濃度為1.03mg/mL。車前子粗多糖的提取率為2.76%，在實(shí)驗(yàn)所用的定容至150mL的總多糖提取液中，粗多糖質(zhì)量濃度為1.84mg/mL。

2.2 兩種提取物的抗氧化活性

2.2.1 提取物清除DPPH自由基效果

圖 1 車前子總黃酮對DPPH自由基的清除效果Fig.1 DPPH free radical scavenging ability of flavonoid from Semen Plantaginis

圖 2 車前子總多糖對DPPH自由基的清除效果Fig.2 DPPH free radical scavenging ability of polysaccharide from Semen Plantaginis

由圖1、2可知，總多糖提取物在18.37～183.70mg/L范圍內(nèi)對該自由基的清除率為25.88%～92.93%，相當(dāng)于53.87～185.7μmol/L的Trolox；總黃酮提取物在10.25～102.50mg/L范圍內(nèi)對該自由基的清除率為19.15%～94.10%，相當(dāng)于40.63～188.10μmol/L的Trolox。DPPH自由基的清除率與車前子總黃酮、總多糖提取物的含量有顯著的正相關(guān)性，總黃酮提取物和總多糖提取物的IC50值分別為49.20mg/L和77.42mg/L，此時Trolox的IC50值為25.03mg/L，表明車前子兩種提取物在清除DPPH自由基方面能力較弱，同時，總黃酮提取物清除DPPH自由基的能力強(qiáng)于總多糖提取物。

2.2.2 提取物的鐵還原能力

圖 3 車前子總黃酮的還原力Fig.3 Ferric reducing power of flavonoid from Semen Plantaginis

由圖3、4可知，兩種提取物的含量與還原力呈現(xiàn)出顯著的量效關(guān)系，總多糖提取物在18.37～61.17mg/L范圍內(nèi)，鐵還原力為0.31～1.34，相當(dāng)于55.90～180.70μmol/L的Trolox，而總黃酮提取物在10.25～33.83mg/L范圍內(nèi)，鐵還原力為0.29～0.91，相當(dāng)于39.61～122.60μmol/L的Trolox。此時Trolox的IC50值(此處IC50表示還原力為0.5時對應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度)為17.08mg/L，總黃酮提取物和總多糖提取物的IC50值分別為18.45mg/L和 20.71mg/L，表明車前子總黃酮和總多糖的還原力略小于Trolox，且車前子總黃酮的鐵還原力強(qiáng)于總多糖。

圖 4 車前子總多糖的還原力Fig.4 Ferric reducing power of polysaccharide from Semen Plantaginis

2.2.3 提取物清除ABTS+·的效果

圖 5 車前子總黃酮對ABTS+·的清除率Fig.5 ABTS+· scavenging action of flavonoid from Semen Plantaginis

圖 6 車前子總多糖對ABTS+·的清除率Fig.6 ABTS+· scavenging action of polysaccharide from Semen Plantaginis

由圖5、6可知，車前子總多糖提取物在18.37～ 1 8 3.7 0 m g/L 范圍內(nèi)，對A B T S+·的清除率范圍為30.74%～99.30%，相當(dāng)于56.78～190.30μmol/L的Trolox；總黃酮提取物在10.25～102.50mg/L范圍內(nèi)，自由基清除率范圍是25.69%～99.41%，相當(dāng)于48.96～190.50μmol/L的Trolox?？傸S酮和總多糖提取物清除ABTS+·的IC50值分別約為21.41mg/L和30.52mg/L，Trolox的IC50值為24.92mg/L。因此，在ABTS+·清除能力上，總黃酮提取物＞Trolox＞總多糖提取物。

2.3 MTT法檢測結(jié)果

6-OHDA是腦內(nèi)多巴胺的氧化代謝產(chǎn)物，它通過產(chǎn)生活性氧，造成線粒體的氧化損傷，繼而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)腦神經(jīng)細(xì)胞死亡[13]。6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞死亡模型是最常用的神經(jīng)退行性疾病研究模型之一[14]。

2.3.1 車前子提取液對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

圖 7 車前子提取物對SH-SY5Y細(xì)胞活力影響Fig.7 Effects of Semen Plantaginis extracts on SH-SY5Y cell viability

首先檢測車前子總黃酮和總多糖提取物對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用。由圖7可知，車前子的兩種提取液在實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞都沒有明顯毒性，甚至在不同程度上促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。與對照組相比，總多糖提取物組顯著促進(jìn)了SH-SY5Y細(xì)胞的增殖。

2.3.2 車前子提取物對6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y損傷模型細(xì)胞存活率的影響

圖 8 車前子提取物對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y損傷模型的影響Fig.8 Protective effects of Semen Plantaginis extract against 6-OHDAinduced SH-SY5Y cell death

由圖8可知，車前子兩種提取物對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞死亡均有抑制作用。神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)200μmol/L 6-OHDA處理后，細(xì)胞存活率明顯降低，僅為33.91%，而使用稀釋10倍和100倍的車前子總多糖和總黃酮提取液預(yù)處理細(xì)胞，則可以有效的抑制6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，在10倍稀釋提取液的作用下，細(xì)胞存活率提高至64.59%(總黃酮提取物處理組)和78.71%(總多糖提取物處理組)，二者與6-OHDA處理組相比具有極顯著差異(P＜0.01)。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以推斷車前子提取物對細(xì)胞死亡的抑制作用可能與其清除自由基、發(fā)揮抗氧化作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。但其具體調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

超聲波輔助提取車前子總黃酮，其提取率為1.54%，水浸提法提取車前子總多糖，其提取率為2.76%。

兩種車前子提取物均具有一定的體外抗氧化性，二者在清除DPPH自由基的能力方面較弱，但清除ABTS+·活性和鐵還原能力都接近于Trolox，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且整體上，車前子總黃酮的抗氧化能力強(qiáng)于總多糖。

車前子的兩種提取物對SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞沒有毒性，二者對神經(jīng)毒性物質(zhì)6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞死亡均有不同程度的抑制作用，且抑制效果呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。

下一步的研究工作將對提取物中總黃酮和總多糖作進(jìn)一步的分離、純化和鑒定，探討發(fā)揮抗氧化活性的主要單體成分，并通過動物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)揭示這些活性物質(zhì)在神經(jīng)退行性疾病方面發(fā)揮作用的相關(guān)機(jī)理。

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