周諾 黃旋平 江獻芳 宋繼傳 李華 謝慶條

[摘要] 目的 探討人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）復(fù)合可注射骨組織工程支架材料對氧化聚乙烯和聚丙烯共聚物（Pluronic F-127）移植對兔下頜骨牽張成骨新骨形成的促進作用。方法 將48只新西蘭白兔隨機分為4組，每組12只。建立下頜骨牽張成骨動物模型，固定期第2天A組于牽張間隙注射200 μL BMP-2基因修飾BMSCs與Pluronic F-127復(fù)合物；B組注射等量BMP-2基因修飾BMSCs液；C組注射等量BMSCs液；D組注射等量生理鹽水。分別于固定2、6周時處死半數(shù)動物獲取標(biāo)本，通過X線片、組織切片及免疫組化觀察骨質(zhì)愈合改建情況。結(jié)果 通過X線片及免疫組化觀察并經(jīng)過統(tǒng)計軟件分析，在固定2周和6周時，A組牽張區(qū)內(nèi)骨密度和BMP-2蛋白的表達明顯高于B、C、D組（P<0.01），B組明顯高于C組和D組（P<0.01）；C組和D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。A、B組間隙內(nèi)成骨質(zhì)量好于C、D組，A組好于B組。結(jié)論 BMP-2基因修飾BMSCs復(fù)合可注射骨組織工程支架材料Pluronic F-127移植能有效促進兔下頜骨牽張成骨新骨形成。

[關(guān)鍵詞] 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2； 基因； 骨髓間充質(zhì)干細胞； 對氧化聚乙烯和聚丙烯共聚物； 牽張成骨； 新骨形成

[中圖分類號] R 781 [文獻標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.008

研究[1-5]表明牽張成骨（distraction osteogenesis，DO）在顱頜面整形、腫瘤術(shù)后重建、牙槽種植等方

面有廣闊的應(yīng)用前景。但牽張成骨的某些局限性如牽張速度受限、治療周期長等問題限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此，尋找一種有效促進牽張成骨新骨形成的方法來縮短其治療周期成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

對氧化聚乙烯和聚丙烯共聚物（Pluronic F-127）

（Sigma公司，美國），SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德公司），X線機（青島海諾公司），病理圖像分析儀（DMR+Q550，Leica公司，德國），兔下頜骨牽張器（西安中邦公司定制）。

1.2 實驗動物

選取廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供的健康新西蘭白兔48只為研究對象，兔齡2～3個月，體質(zhì)量2.0～2.5 kg。

1.3 干預(yù)分組

將48只新西蘭白兔隨機分為4組，每組12只。在牽張結(jié)束后固定期第2天，A組于牽張間隙注射200 μL骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，

BMP-2）基因修飾骨髓基質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）與Pluronic F-127的復(fù)合物；B

組注射等量BMP-2基因修飾BMSCs液；C組為對照組，注射等量自體BMSCs液；D組為空白對照，注射等量生理鹽水。

1.4 方法

1.4.1 人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（human bone morphoge-

netic protein-2，hBMP-2）基因克隆及真核表達載體的構(gòu)建 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcrip-tion-polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)從人

骨肉瘤中擴增出hBMP-2基因片段，通過DNA重組技術(shù)將該基因片段重組于pcDNA 3.1真核表達載體上，構(gòu)建成pcDNA3.1-hBMP2重組質(zhì)粒[6]。

1.4.2 兔自體BMSCs的分離培養(yǎng)及hBMP-2基因轉(zhuǎn)染修飾 術(shù)前分別根據(jù)編號對實驗各組動物自脛骨上端穿刺抽取骨髓，并做好對應(yīng)編號進行傳代培養(yǎng)，將兔自體BMSCs培養(yǎng)傳代至第3代細胞后行hBMP-2基因轉(zhuǎn)染修飾[7]。

1.4.3 Pluronic F-127與hBMP-2基因轉(zhuǎn)染修飾兔BMSCs的混合 注射前將所收集的用BMP-2基因轉(zhuǎn)染修飾的2×107個兔BMSCs離心去上清，然后加含滅活血清的DMEM培養(yǎng)基0.3～0.4 mL制成細胞懸液，再加入Plu-ronic F-127支架材料0.3～0.4 mL，細胞懸液與Pluronic F-127的比例為1∶1，充分混勻，制成細胞濃度為每毫升1×106個的細胞混合懸液，振蕩混勻，放4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 模型制備 采用3%戊巴比妥鈉（按1 mL·kg-1

給藥）耳緣靜脈注射麻醉，平行下頜下緣做切口，長

約3～4 cm，切開皮膚、皮下組織直達骨面，在下頜角前1.0 cm處用牙科渦輪機做垂直骨切開（圖1），確認(rèn)骨斷開后按預(yù)先所留固位孔安裝牽張器（圖2），分

層縫合傷口。術(shù)后延遲期為5 d，第6天開始牽張，每天2次，每次0.5 mm牽張，牽張長度7 mm，隨后固定。在固定期第2天，于牽張間隙按上述分組進行藥物注射治療。

圖 1 切開骨皮質(zhì)

Fig 1 Incision of cortical bone

圖 2 安置牽張器

Fig 2 Placement of distractor

1.4.5 獲取標(biāo)本 固定期2、6周時各組分別處死半數(shù)動物，取術(shù)側(cè)下頜骨標(biāo)本，切取牽張區(qū)域及其周圍新骨組織標(biāo)本，根據(jù)檢測項目需要拍攝術(shù)側(cè)下頜骨X線片，然后根據(jù)檢測方法需要分別對標(biāo)本進行相關(guān)處理。

1.4.6 X線片檢查及骨密度分析 將固定2、6周各組獲取的標(biāo)本分別攝X線片觀察骨質(zhì)愈合、改建情況。拍攝距離35.0 cm，曝光時間0.25 s。獲得的膠片經(jīng)掃描轉(zhuǎn)化為數(shù)字圖像后用專用軟件進行骨密度分析。在X線片上的牽張區(qū)域水平和垂直方向平均各取3條線，線上各點骨密度平均值數(shù)據(jù)以x±s表示，作為統(tǒng)計分析的原始數(shù)據(jù)進行骨密度分析。

1.4.7 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色 將

經(jīng)10%甲醛固定的標(biāo)本放入15%乙二胺四乙酸（ethy-lenediamine tetraacetic acid，EDTA）溶液（pH值7.2～7.4）中脫鈣，直到用大頭針能順利穿透標(biāo)本為止，后

梯度乙醇脫水，石蠟包埋后制備成4 μm厚度的石蠟切片，600 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，復(fù)水后蘇木素染色，1%鹽酸乙醇酚化，碳酸鋰返藍，伊紅染色，乙醇脫水，放干燥箱干燥，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.4.8 免疫組織化學(xué) 將獲得的脫鈣標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，孵育，沖洗，加一抗BMP-2，同時做不加一抗的對照片，以便于結(jié)果判讀；然后加二抗，孵育，DAB顯色后水洗，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗返藍，干燥，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果，棕黃色染色為陽性染色，免疫組織化學(xué)染色后的切片用病理圖像分析儀進行測量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，對各時期各組數(shù)據(jù)行單因素方差分析和多個樣本均數(shù)兩兩比較的q檢驗（Newman-Keuls法），檢驗水準(zhǔn)為α=

0.05。

2 結(jié)果

2.1 X線片分析

固定2周時，A組牽張間隙新生骨組織影像密度較高，新生骨組織與原骨組織之間骨融合良好，界限非常模糊（圖3A）。B組、C組及D組牽張間隙新生骨組織影像均呈現(xiàn)低密度影，與周圍原骨組織影像界限都比較明顯。B組牽張間隙內(nèi)新生骨組織密度較C組、D組稍高，下頜骨下緣骨皮質(zhì)厚而連續(xù)，骨切開線兩端仍可清晰辨認(rèn)（圖3B）。C組和D組牽張間隙內(nèi)骨密度影更低，兩者牽張間隙內(nèi)骨密度無明顯差別，牽張間隙內(nèi)新生骨與兩端正常下頜骨影像界限更為明顯，很容易辨認(rèn)（圖3C、D）。

固定6周時，A組牽張間隙新生骨組織與周圍原骨組織影像密度相似，新生骨組織與原骨組織之間已完全達到骨融現(xiàn)象，分不清骨界限（圖4A）；B、C、D組牽張間隙內(nèi)新生骨影像均比固定2周時明顯增高，而B組牽張間隙內(nèi)新生骨影像表現(xiàn)為稍高密度影，新生骨組織和原骨周圍骨組織之間界限較模糊，難以辨認(rèn)（圖4B）；C組和D組牽張間隙新生骨組織影像密度明顯低于A組和B組，邊緣均逐漸變模糊，但仍容易辨認(rèn)，新生骨與周圍骨影像均開始出現(xiàn)融合現(xiàn)象（圖4C、D）。

固定2周時，A、B、C、D組的骨密度值分別為70.67±2.11、46.00±1.13、28.79±1.68、27.94±1.21；固定6周時，A、B、C、D組骨密度值分別為98.82±2.72、72.78±2.67、58.72±1.26、56.10±2.18。在固定2周和6周時A組牽張區(qū)內(nèi)骨密度明顯高于B、C、D組（P<

0.01），B組牽張區(qū)內(nèi)骨密度明顯高于C組和D組（P<

0.01），C組和D組牽張區(qū)骨密度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 HE染色觀察結(jié)果

固定2周時，A組牽張間隙內(nèi)已形成良好的骨小梁，骨小梁排列規(guī)則有序，基本沿著牽張方向排列，周圍集聚大量活躍成骨細胞（圖5A）；B組牽張間隙

內(nèi)亦已形成大量骨小梁結(jié)構(gòu)，骨小梁排列極不規(guī)則，方向各異，骨小梁邊緣聚集大量活躍成骨細胞和間充質(zhì)細胞（圖5B）；C組和D組組織結(jié)構(gòu)相似，牽張間

隙內(nèi)均有大量活躍的成纖維細胞、間充質(zhì)細胞和成骨細胞，并可見少量新生血管和骨小梁結(jié)構(gòu)（圖5C、D）。

固定6周時，A組牽張間隙內(nèi)已形成成熟的板層骨結(jié)構(gòu)，可見有清晰的哈弗氏管結(jié)構(gòu)（圖6A）；B組

牽張間隙內(nèi)骨小梁增粗、變大、規(guī)則，基本沿著牽張方向排列，新生骨組織接近正常骨組織水平，可見有少量哈弗氏管結(jié)構(gòu)（圖6B）；C組和D組牽張間隙內(nèi)開始出現(xiàn)大量新生骨小梁，骨小梁排列雜亂無章，方向各異，骨小梁周圍是大量活躍的成纖維細胞、成骨細胞和間充質(zhì)細胞（圖6C、D）。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

固定2周時，A組新生骨小梁膠原基質(zhì)及其周圍的骨細胞、成骨細胞高度著色，均被染為較深的棕色，提示這些細胞和組織內(nèi)有BMP-2蛋白的高表達（圖7A）；B組新生骨小梁膠原基質(zhì)及其周圍的骨細胞、成骨細胞亦著色較深，提示這些細胞和組織內(nèi)BMP-2蛋白表達水平亦較高（圖7B）；C組和D組牽張間隙內(nèi)的成骨細胞、間充質(zhì)細胞及新生血管周圍亦可見被染的棕色，但染色略淺于B組，提示這些細胞和組織有BMP-2蛋白的表達，但表達不如A、B組高（圖7C、D）。

固定6周時，A組牽張間隙內(nèi)新生骨小梁膠原基質(zhì)、骨細胞、成骨細胞被染為較深的棕色（圖8A）；

B組牽張間隙內(nèi)新生骨小梁膠原基質(zhì)、骨細胞、成骨細胞較A組稍淺（圖8B）；C組和D組新生骨小梁膠原基質(zhì)及其周圍的骨細胞、成骨細胞亦被輕度染為棕色，但與A組和B組相比，著色較淺（圖8C、D）。

固定2周時，A、B、C、D組BMP-2蛋白表達平均灰度值分別為78.86±6.53、114.75±7.71、176.31±8.21、180.16±8.11；固定6周時，A、B、C、D組BMP-2蛋白表達平均灰度值分別為126.61±8.73、199.66±9.46、231.63±8.35、238.98±5.85。統(tǒng)計結(jié)果表明：固定2、6周A組平均灰度值均明顯低于B、C、D各組（P<0.01），B組平均灰度值明顯低于C組和D組（P<0.01），

而C組和D組間相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

組織工程是將體外培養(yǎng)、擴增的正常組織細胞吸附于一種生物相容性良好并可被機體吸附的生物材料上形成復(fù)合物，將此復(fù)合物植入機體組織、器官的病損部位，細胞在生物材料逐漸吸收的過程中，形成新的具有形態(tài)和功能的相應(yīng)組織、器官，達到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的[8]。牽張成骨技術(shù)因其

本身許多無可替代的優(yōu)越性使其在顱頜面外科領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，但其治療周期過長一直是困擾臨床醫(yī)師的難題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和骨創(chuàng)傷愈合機制研究的進展，人們已認(rèn)識到骨生長因子在骨代謝和修復(fù)中的重要作用，企圖將外源性生長因子應(yīng)用于牽張成骨或骨折愈合區(qū)，從而加速骨創(chuàng)傷愈合修復(fù)過程。但臨床效果卻不盡人意[9-11]。由于外源性應(yīng)用生長因子促進牽張成骨或骨創(chuàng)傷愈合的研究進展緩慢，且效果難以肯定，因此，相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者都在積極尋找能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生內(nèi)源性生長因子促進牽張成骨或骨創(chuàng)傷愈合的方法。

1998年Cao等[12]研究表明：Pluronic F-127是一

種生物相容性和可降解性的軟骨細胞培養(yǎng)支架，能運載分離的軟骨細胞，并促進軟骨細胞的增殖，作為一種新型可注射性支架材料，它是一種溫敏型材料，在0～4 ℃時為液態(tài)，超出此范圍則變?yōu)槟z，降解時間約為6周。可見，Pluronic F-127不失為一種較理想的組織工程生物材料。在本實驗中用BMP-2作為成骨性誘導(dǎo)因子，利用基因轉(zhuǎn)染方法將其導(dǎo)入兔BMSCs，將其與可注射骨組織工程支架材料Pluronic F-127復(fù)合，并注入到兔下頜牽張成骨區(qū)。通過X線片檢測發(fā)現(xiàn)，在固定2周和6周時A組牽張區(qū)內(nèi)骨密度明顯高于B、C、D組（P<0.01），B組牽張區(qū)內(nèi)骨密度明顯高于C組和D組（P<0.01），C組和D組牽張區(qū)骨密度比較無明顯差異（P>0.05）。通過免疫組化顯示：A組平均灰度值明顯低于B、C、D組（P<0.01），B組平均灰度值明顯低于C組和D組（P<0.01），而C組和D組間相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明A組

和B組BMP-2蛋白出現(xiàn)高表達，而A組明顯高于B組，C組和D組BMP-2蛋白表達比較差異不大。HE染色結(jié)果亦提示，在固定2周和6周時，A組骨痂形成質(zhì)量明顯高于B、C、D組，而B組骨痂形成質(zhì)量又高于C、D組，C組和D組比較差異不大。根據(jù)以上實驗結(jié)果推測：通過BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs與Pluronic F-127

復(fù)合注射治療后，在基因、細胞及支架材料等多方面共同作用誘導(dǎo)下BMP-2蛋白出現(xiàn)高表達。BMP-2基因進一步誘導(dǎo)BMSCs自身或牽張成骨區(qū)的多潛能干細胞以及可能的成纖維細胞向成骨或成軟骨細胞分化，使成骨級聯(lián)再次啟動，重續(xù)定向成骨分化，最終達到促進牽張成骨新骨形成與改建的目的。實驗中筆者通過X線片、HE染色檢查發(fā)現(xiàn)：從成骨質(zhì)量和質(zhì)地上看，A組明顯優(yōu)于其余各組；B組成骨質(zhì)量稍差于A組，可能是由于缺乏支架材料的作用；而C組和D組在成骨上無明顯差異，可能由于沒有支架材料及細胞因子的作用，BMSCs很快被降解和稀釋的緣故，因而未能達到促進成骨的作用。

Urist等[13]將骨誘導(dǎo)定義為：在一種可擴散的骨

形態(tài)發(fā)生蛋白的作用下，間充質(zhì)細胞向著形成軟骨和骨的方向發(fā)展。根據(jù)Urist的觀點，發(fā)生骨誘導(dǎo)必須具備3個條件：l）存在可分化為成骨細胞的間充質(zhì)細胞即靶細胞；2）存在引導(dǎo)間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化的生物化學(xué)信號；3）適當(dāng)?shù)某晒黔h(huán)境。本實驗中將基因細胞材料注入到兔子牽張間隙后，Pluronic F-127支架材料孔隙內(nèi)有可能充滿了纖維結(jié)締組織和毛細血管，毛細血管末稍存在的正在分化的間充質(zhì)細胞即是向成骨細胞分化的靶細胞?？梢哉T導(dǎo)間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化的生物化學(xué)信號來自支架材料對于體內(nèi)骨生長生化信號分子的富集。具有骨誘導(dǎo)作用的Pluronic F-127植入體內(nèi)后，其材料的多孔結(jié)構(gòu)在孔隙內(nèi)造成了一個有利于新骨形成的高鈣、磷離子濃度的環(huán)境，特別有利于蛋白、骨組織細胞等的附著，以及骨組織細胞的分化和增殖，從而提供了一個優(yōu)良的成骨環(huán)境，最終促進了牽張成骨新骨形成和改建的過程。

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（本文編輯 杜冰）