張同韓等

[摘要] 目的 明確Notch信號(hào)通路受體Notch1、Notch3及其配體Jagged1、Jagged2在舌鱗癌中的表達(dá)及其意義。方法 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)74例舌癌患者的組織標(biāo)本（舌癌及癌旁組織）和人舌癌Cal-27細(xì)胞株中Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2 mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，分析其與細(xì)胞增殖及臨床病理的關(guān)系。結(jié)果 舌癌、癌旁組織及Cal-27細(xì)胞株中均檢測(cè)到Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。Notch1和Notch3蛋白在舌癌中的表達(dá)率高于癌旁組織，而Jagged1和Jagged2蛋白在舌癌和癌旁組織中的表達(dá)率無(wú)明顯差異。Notch1和Notch3蛋白的表達(dá)和舌癌的臨床分期具有相關(guān)性。4種信號(hào)蛋白的表達(dá)與患者的年齡、性別和臨床病理分級(jí)無(wú)相關(guān)性。Notch3和Jagged2的表達(dá)具有相關(guān)性。Notch1蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例中的表達(dá)率高于轉(zhuǎn)移陰性的病例，Jagged1在轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例的表達(dá)分級(jí)高于陰性病例。結(jié)論 Notch信號(hào)通路分子在舌鱗癌中表達(dá)活躍，與舌癌的發(fā)生發(fā)展有重要的相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 口腔癌； 口腔黏膜； Notch； Jagged1； 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)； 舌癌

[中圖分類(lèi)號(hào)] R 739.86 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.021

Notch信號(hào)途徑是由配體、受體以及下游的DNA結(jié)合蛋白構(gòu)成的連鎖信號(hào)通路；配體包括Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4等，受體包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4等[1-2]，其下游蛋白有HES1

和HES5等[3]。雖然這些配體和受體在結(jié)構(gòu)上有諸多

相似之處，但作用迥異[2]。Notch信號(hào)通路可以參與

多種細(xì)胞過(guò)程[4]，其異常與各種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[5]；

根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和組織類(lèi)型不同而具有抑瘤或者促瘤作用[6]，在同一組織不同疾病中也可能具有抑瘤或者

促瘤作用[7]。本研究擬探討Notch1、Notch3、Jagged1

和Jagged2的mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，并研究其與患者的臨床病理特征之間的聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

1.1.1 病例 選取2005—2007年間在中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院診斷為舌癌并行手術(shù)治療的74例患者采集樣本；所有病例均為未經(jīng)放化療的原發(fā)病例，年齡為25～77歲，平均年齡54.5歲，男性40例，女性34例；TNM分期和病理分級(jí)見(jiàn)表1。

1.1.2 組織標(biāo)本的收集 所有標(biāo)本均為術(shù)中獲取，癌旁標(biāo)本取自舌癌邊界以外2 cm的舌黏膜，均經(jīng)病理證實(shí)。標(biāo)本一部分放入-80 ℃保存，準(zhǔn)備提取RNA和蛋白質(zhì)；另一部分放入甲醛溶液中固定，石蠟包埋后采用免疫組織化學(xué)染色。

1.2 細(xì)胞株

人舌鱗狀上皮癌細(xì)胞株Cal-27購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC）。

1.3 引物

本實(shí)驗(yàn)用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse trans-

criptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）的引物由大連TAKARA公司合成，引物序列見(jiàn)表2。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

Cal-27細(xì)胞采用免疫熒光化學(xué)染色，按照常規(guī)方法操作，進(jìn)行異硫氰酸熒光素（fluorescein isothio-cyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記和二脒基苯基吲哚（diamidino-phenyl-indole，DAPI）染色；臨床組織樣本采用免疫組織化學(xué)染色，按常規(guī)方法操作。細(xì)胞總RNA的提取按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，RNA質(zhì)量檢測(cè)合格后，通

過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA即可用于聚合酶鏈反應(yīng)（poly-

merase chain reaction，PCR）。PCR擴(kuò)增按下列程序做循環(huán)：Notch1、Jagged1、Jagged2和β-actin，94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火51 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；Notch3，94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，61.8 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。上述所有反應(yīng)到最后都要在72 ℃下總延伸10 min，完成后電泳。組織蛋白提取后，根據(jù)質(zhì)量濃度調(diào)整上樣量，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），采用槽式濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行Western blot。

1.5 結(jié)果判定

1.5.1 免疫組織化學(xué)染色 400倍光鏡下盲法讀片，細(xì)胞內(nèi)有棕黃色染色者為陽(yáng)性。選取10個(gè)隨機(jī)的不同的視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)Y和細(xì)胞總數(shù)T[8]，求出

每例的Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2的陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)L。L=Y/T×100%。以L值的大小進(jìn)行分級(jí)，表示染色強(qiáng)度的強(qiáng)弱：0級(jí)（L=0），1級(jí)（0

1.5.2 PCR與Western blot相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定 各樣本Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2的相對(duì)表達(dá)量為Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2條帶灰度值與內(nèi)參照β-actin條帶灰度值的比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以x±s描述結(jié)果。采用SPSS 13.0軟件用方差分析和卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，若方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)，若條件不滿(mǎn)足卡方檢驗(yàn)者采用Fisher法；檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR的擴(kuò)增結(jié)果

2.1.1 Notch信號(hào)分子mRNA在舌癌細(xì)胞株中的表達(dá)

RT-PCR的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1：Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2 mRNA在Cal-27中均有表達(dá)。

2.1.2 Notch信號(hào)分子mRNA在臨床組織標(biāo)本中的表達(dá) 在舌癌及癌旁組織中均可檢測(cè)到Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2 mRNA的表達(dá)（圖2）。對(duì)凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行灰度分析，舌癌組織中的相對(duì)表達(dá)量較癌旁組織高，二者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 Western blot測(cè)定結(jié)果

在Cal-27細(xì)胞株、舌癌和癌旁組織中均檢測(cè)到了Notch信號(hào)蛋白的表達(dá)，與免疫組織化學(xué)和RT-PCR的結(jié)果一致（圖3、4）。

2.3 免疫組織化學(xué)分析

2.3.1 Notch信號(hào)蛋白在Cal-27細(xì)胞株中的表達(dá) 通過(guò)免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)到Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2在Cal-27細(xì)胞株中的表達(dá)見(jiàn)圖5。細(xì)胞中Notch1、Notch3主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)及細(xì)胞膜，部分表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)；Jagged1主要表達(dá)在細(xì)胞膜，少部分弱表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；Jagged2主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜。

1：病例1的舌癌組織；2：病例1的癌旁組織；3：病例2的舌癌組織；4：病例2的癌旁組織。

2.3.2 Notch信號(hào)蛋白在臨床組織標(biāo)本中的表達(dá) 在腫瘤及癌旁組織內(nèi)，Notch1大部分表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，偶爾表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞核內(nèi)；Notch3在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有表達(dá)；Jagged1和Jagged2主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。在癌旁組織內(nèi)，Notch1強(qiáng)烈和廣泛地表達(dá)于基底層和棘層，而微弱和局限地表達(dá)于顆粒層和角化層（圖6A）；Notch3強(qiáng)烈和廣泛地表達(dá)于基底層和棘層（圖6B）；Jagged1強(qiáng)烈和廣泛地表達(dá)于基底層和棘層，而微弱和局限地表達(dá)于顆粒層和角化層（圖6C）；Jagged2強(qiáng)烈和廣泛地表達(dá)于基底層（圖6D）。Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2在

舌癌腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)（圖7）。

2.4 Notch1和Notch3在舌癌的表達(dá)率高于其在癌旁

組織的表達(dá)率

Notch受體和配體蛋白在舌癌及癌旁組織的表達(dá)率有所不同。Notch1在癌旁組織的表達(dá)率為36.5%（27例），而在舌癌中的表達(dá)率為56.8%（42例），明顯高于癌旁組織（2=6.10，P=0.013）。Notch3在癌旁組織的表達(dá)率為47.3%（35例），在舌癌中的表達(dá)率為63.5%（47例），高于癌旁組織（2=3.94，P=0.047）。Jagged1

在癌旁組織中的表達(dá)率為90.5%（67例），在舌癌組織中的表達(dá)率為97.3%（72例），二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=2.96，P=0.166）。Jagged2在癌旁組織中的表達(dá)率為74.3%（55例），在癌組織中的表達(dá)率為83.8%（62例），二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=2.00，P=0.157）。

2.5 Notch受體和配體蛋白在舌癌的表達(dá)與臨床病

理特征的相互關(guān)系

Notch信號(hào)分子的表達(dá)陽(yáng)性率與舌癌患者的年齡、性別、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以及病理分級(jí)間的關(guān)系見(jiàn)表3。Notch1和Notch3的表達(dá)和臨床分期有相關(guān)性（P<0.05），而Jagged1和Jagged2則與臨床分期無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2與病理分級(jí)及性別無(wú)相關(guān)性（表3）。Notch3和Jagged2的表達(dá)有相關(guān)性（表4），其他的則無(wú)相關(guān)性。Notch1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例的表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例（表3）。因?yàn)橹挥?個(gè)病例不表達(dá)Jagged1，所以本研究分析了Jagged1表達(dá)分級(jí)（0、1和2、3）與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例間的關(guān)系，結(jié)果顯示，Jagged1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中表達(dá)分級(jí)更高（表5）。

3 討論

細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生相關(guān)微環(huán)境的調(diào)控均有Notch信號(hào)參與[4]。Notch信號(hào)在腫瘤發(fā)生中既可發(fā)揮抑瘤作用，也可發(fā)揮促瘤作用，這取決于細(xì)胞和組織的類(lèi)型[4，9]。在本研究中，在Cal-27細(xì)胞株、舌癌和癌旁組織中均檢測(cè)到Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2 mRNA的表達(dá)，且其表達(dá)水平在舌癌中高于癌旁的舌黏膜組織。Notch信號(hào)蛋白分子明顯表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，在腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)水平有明顯的差異，微弱和局限地表達(dá)于癌旁舌黏膜組織，但廣泛和強(qiáng)烈地表達(dá)于舌癌組織；Notch1和Notch3蛋白在舌癌中的表達(dá)率亦高于癌旁組織：以上結(jié)果提示Notch信號(hào)通路的受體和配體在舌癌中可能起著癌基因的作用。本研究結(jié)果與其他學(xué)者[9-11]的研究結(jié)果相似。Yao等[10]報(bào)道，應(yīng)用γ-secretase抑制劑L-685、L-458下調(diào)Notch1的表達(dá)可抑制人舌癌Tca8113細(xì)胞系的生長(zhǎng)，伴隨著舌癌細(xì)胞的周期停滯和細(xì)胞凋亡。Panelos等[9]研究認(rèn)為，Notch1在非陽(yáng)光暴露處鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)是上調(diào)的。Hijioka等[11]研究了Notch途徑的基因在細(xì)胞系（人口腔鱗癌細(xì)胞株Ca99-2、HSC-2和HSC-4）和腫瘤中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正?？谇唤M織

中這些基因的表達(dá)相比，Notch1、Notch2和Jagged1的表達(dá)水平上調(diào)，這表明Notch信號(hào)在口腔鱗癌中表達(dá)活躍。這些研究結(jié)果表明，Notch信號(hào)通路在舌鱗癌中是被激活的。

Notch信號(hào)通路參與了人類(lèi)的發(fā)育過(guò)程，在此過(guò)程中它有3種作用類(lèi)型：二元譜系定向、側(cè)向抑制和邊界形成[12]。人類(lèi)一生中，表皮一直都不停地更新，這個(gè)過(guò)程是由表皮基底膜的干細(xì)胞完成的。由周?chē)慕腔?xì)胞發(fā)出的Notch信號(hào)可以引起基底干細(xì)胞的分化，在干細(xì)胞簇的邊界，Notch信號(hào)可刺激人體表皮分化[13]。已有研究[13]顯示，富含干細(xì)胞的基底角化細(xì)胞簇比其周?chē)募?xì)胞表達(dá)更高水平的Notch信號(hào)分子。Notch受體、配體和通路中的其他組分在脊椎動(dòng)物表皮的不同分化階段的角化細(xì)胞均有表達(dá)[14]。Notch受體及其配體在宮頸鱗癌表達(dá)上調(diào)，提示Notch信號(hào)可能參與調(diào)控人角化細(xì)胞的增殖[15]。異常的Notch信號(hào)可以引起上皮癌變，例如鱗癌、基底細(xì)胞癌和惡性黑色素瘤[16]。Notch信號(hào)分子也可作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物在口腔上皮異常增生和口腔鱗癌的發(fā)生中起重要作用[17]。Notch信號(hào)通路成員的失調(diào)引起細(xì)胞的定向發(fā)生和分化信號(hào)異常，導(dǎo)致了口腔鱗癌的發(fā)生[18]。Casey等[19]報(bào)道，Jagged2在整個(gè)口腔上皮細(xì)胞都有表達(dá)并且是口腔上皮細(xì)胞分化過(guò)程中Notch1激活所必須的。本研究結(jié)果中，Notch信號(hào)分子在舌黏膜基底層的表達(dá)高于其他層，而在舌鱗癌細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)烈而彌漫，這些特征可能表明Notch信號(hào)的上調(diào)阻止了舌黏膜基底層干細(xì)胞的分化。Notch信號(hào)在舌癌發(fā)生中起著致癌作用，通過(guò)調(diào)節(jié)舌鱗癌細(xì)胞的分化而參與舌癌的發(fā)生。信號(hào)分子可能對(duì)控制正常舌黏膜上皮細(xì)胞的分化有重要貢獻(xiàn)。類(lèi)似的研究[20-21]表明，在前列腺癌和宮頸癌中Notch信號(hào)的激活是依賴(lài)Jagged1的。

本研究結(jié)果表明，Notch1和Notch3表達(dá)與舌癌的臨床分期具有相關(guān)性，這意味著，Notch信號(hào)通路可能與舌鱗癌的發(fā)展有相關(guān)性；Notch3和Jagged2表達(dá)有高度相關(guān)性，提示在舌鱗癌中Jagged2與Notch3可以相互作用而產(chǎn)生致瘤作用，但其具體機(jī)制還需要研究；在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的舌癌病例中，Notch1和Jagged1表達(dá)率高于陰性病例：這些發(fā)現(xiàn)支持一個(gè)模型，那就是Jagged1蛋白水平的失調(diào)在舌癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了作用，并提示Jagged1可能是區(qū)分舌鱗癌侵襲性強(qiáng)與弱的參考指標(biāo)[20-23]。Sahlgren等[22]已經(jīng)證明，Notch信號(hào)是缺氧刺激誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epi-thelial-mesenchymal transitions，EMT）、增加遷徙和侵襲所必需的；抑制Notch信號(hào)可以廢除缺氧誘導(dǎo)的EMT和侵襲，與此相反，Notch活化形式可以替代缺氧誘導(dǎo)這些過(guò)程而誘導(dǎo)EMT。研究[24]顯示，Notch可調(diào)控Slug阻斷Notch信號(hào)，抑制體內(nèi)腫瘤模型的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；Jagged1激活的Notch信號(hào)通過(guò)調(diào)控Slug抑制E-cadherin而促進(jìn)EMT。Jagged1和Hey1是Notch信號(hào)通路的一個(gè)靶基因，也參與介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β誘導(dǎo)的EMT[25]?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)的結(jié)果，筆者推測(cè)Jagged1可能通過(guò)參與調(diào)控EMT而在舌癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

總之，Notch信號(hào)可以影響舌生理狀態(tài)下的生長(zhǎng)發(fā)育和舌癌病理情況下細(xì)胞的增殖、分化和存活。Notch信號(hào)途徑參與舌癌發(fā)生的分子機(jī)制是十分復(fù)雜的，雖然目前的研究逐漸深入，但距離完全闡明仍有很長(zhǎng)的路要走。闡明精確的信號(hào)通路途徑將為應(yīng)用Notch通路的相關(guān)分子作為靶點(diǎn)治療舌癌提供重要依據(jù)。

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（本文編輯 吳愛(ài)華）