趙海霞 馬肅 陳力 劉培紅 徐晶 侯琳 陳蕊 秦春林

[摘要] 目的 分析尼古丁對(duì)大鼠牙槽骨和頜骨內(nèi)鈣磷含量以及堿性磷酸酶（ALP）活性的影響。方法 將20只5周齡健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組每天腹腔注射尼古丁0.73 mg·kg-1，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水，3個(gè)月后處死取材。濃酸消化法檢測(cè)牙槽骨和頜骨內(nèi)鈣磷含量，改良Reddi法檢測(cè)牙槽骨和頜骨內(nèi)ALP活性。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分別行獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。結(jié)果 與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組牙槽骨內(nèi)和頜骨內(nèi)鈣磷含量均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；ALP活性無明顯變化（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組中牙槽骨與頜骨比較，骨鈣磷含量和ALP活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 尼古丁下調(diào)大鼠牙槽骨和頜骨內(nèi)鈣磷含量，對(duì)ALP活性的影響不明顯。

[關(guān)鍵詞] 尼古丁； 牙槽骨； 頜骨； 鈣； 磷； 堿性磷酸酶

[中圖分類號(hào)] R 781.4 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.002

流行病學(xué)研究顯示：吸煙與牙周炎的普遍性、嚴(yán)重性及骨喪失關(guān)系密切；對(duì)牙周治療有負(fù)面影響，常影響牙周治療的效果。吸煙者牙周炎的臨床體征明顯有別于非吸煙者，如牙周探診出血少、牙周袋深、牙槽骨喪失嚴(yán)重等[1-2]。

尼古丁作為煙草中的主要生物堿，能促進(jìn)機(jī)體釋放神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，限制抗體的產(chǎn)生，影響外周免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞；減少機(jī)體對(duì)鈣的吸收從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，影響成骨和骨的礦化[3]。體外研究[4]發(fā)現(xiàn)尼古丁通過抑制成骨細(xì)胞的增殖、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和Ⅰ型膠原纖維（collagen type Ⅰ，COL1）的分泌從而抑制骨形成及礦化。但關(guān)于

尼古丁對(duì)骨形成和改建影響的體內(nèi)研究尚缺乏相關(guān)報(bào)道，其機(jī)制尚不清楚。

骨形成過程包括成骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟、細(xì)胞外基質(zhì)礦化和成骨細(xì)胞凋亡4個(gè)階段。生物礦化則是指細(xì)胞合成和分泌有機(jī)基質(zhì)后，鈣和磷酸根不斷沉積其中，當(dāng)達(dá)到飽和度時(shí)，在基質(zhì)上與非膠原蛋白結(jié)合形成磷酸鈣晶核，晶核長大為晶體，與基質(zhì)一起組成結(jié)構(gòu)有序的礦化組織。礦化組織中的無機(jī)物主要是鈣和磷，ALP在礦化組織細(xì)胞如成

骨細(xì)胞中高表達(dá)，是生物礦化的重要標(biāo)記[5-7]。本實(shí)驗(yàn)擬通過定量檢測(cè)腹腔注射尼古丁動(dòng)物模型不同部位骨內(nèi)的鈣磷含量以及ALP活性的差異，初步探討尼古丁對(duì)骨礦化的影響。

1 材料和方法

1.1 藥物、試劑和儀器

尼古丁（北京伊普瑞斯科技有限公司），對(duì)硝基苯磷酸二鈉（disodium 4-nitrophenyl phosphate，PNPP）

（Sigma公司，美國），電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（熱電公司，美國），微波消解儀（型號(hào)MARS-5，培安公司，美國），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（天津市中環(huán)

實(shí)驗(yàn)電爐有限公司），電子天平（型號(hào)AB204-s，梅特

勒公司，瑞士）。

1.2 動(dòng)物的選擇、分組和建模

選取由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的5周齡健康雄性Wistar大鼠20只為研究對(duì)象，體重為120～140 g。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組每天腹腔注射尼古丁0.73 mg·kg-1，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 取材和組織生物化學(xué)檢測(cè)

建模3個(gè)月后取材。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，在碎冰上解剖大鼠下頜骨后，除凈附著的軟組織，剪除切牙部分，獲取下頜切牙區(qū)牙槽骨，同時(shí)剪取下頜支部分，分別用濕紗布包裹后，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.1 骨鈣骨磷的測(cè)定 自-80 ℃冰箱取出大鼠左側(cè)下頜牙槽骨和頜骨標(biāo)本分別稱濕重，利用阿基米德原理測(cè)定樣本的體積，電熱恒溫箱烘干至恒重后進(jìn)行以下測(cè)定。1）骨干重測(cè)定：電子天平稱量，精確到0.000 1 g；2）骨礦物質(zhì)測(cè)定：取鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液配

制成10、50、100、200、500×10-6的標(biāo)準(zhǔn)系列；取磷標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成5、25、50、100、250×10-6的標(biāo)準(zhǔn)系列。每個(gè)樣本分別置于消化罐中并加入1 mL去離子水、2 mL 30%過氧化氫、5 mL濃硝酸，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，密閉后置微波消解儀中消化2 h，樣本最后定容至25 mL，借用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀，光譜系為178.2條件下測(cè)定骨鈣骨磷含量，求單位體積的骨鈣骨磷含量。

1.3.2 ALP測(cè)定 自-80 ℃冰箱取出大鼠右側(cè)下頜牙槽骨和頜骨樣本分別稱濕重，用改良Reddi法[8]，至勻漿機(jī)內(nèi)加入冰預(yù)冷的生理鹽水2 mL勻漿，10 000 r·min-1離心10 min。取上清液100 μL，加入1 mmol·L-1 PNPP 50 μL，37 ℃孵育15 min，加1 mol·L-1 NaOH 50 μL中止反應(yīng)，在405 nm波長酶標(biāo)儀下測(cè)定光密度（optical density，OD）值，計(jì)算單位體積的ALP。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠牙槽骨和頜骨內(nèi)鈣磷含量和ALP活性的數(shù)值行完全隨機(jī)分組的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)照組大鼠牙槽骨內(nèi)鈣磷總含量約占其重量的42%，鈣/磷比值為2.36，ALP活性為1.679；頜骨內(nèi)鈣磷總含量約占其重量的41%，鈣/磷比值為2.39，ALP活性為1.170。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：牙槽骨內(nèi)鈣磷含量與頜骨內(nèi)鈣磷含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=

0.079、0.180）；牙槽骨內(nèi)ALP活性與頜骨內(nèi)ALP活性比較有明顯差異（P=0.041）（圖1、2）。

圖 2 尼古丁對(duì)大鼠牙槽骨和頜骨內(nèi)ALP活性的影響

Tab 2 The effects of nicotine on the ALP activity in rat alveolar

bone and mandible

實(shí)驗(yàn)組大鼠牙槽骨內(nèi)鈣磷總含量約占其重量的40%，鈣/磷比值為2.35，ALP活性為1.545；頜骨內(nèi)鈣磷總含量約占其重量的39%，鈣/磷比值為2.41，ALP活性為1.013。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組大鼠牙槽骨

內(nèi)鈣磷含量和ALP活性與頜骨內(nèi)鈣磷含量和ALP活性相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.500、0.528、0.065）。與對(duì)照組大鼠相比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠牙槽骨內(nèi)和頜骨內(nèi)鈣磷含量均明顯減少（P=0.010、0.020，P=0.034、0.019），ALP活性無明顯差異（P=0.644、0.380）（圖

1、2）。

3 討論

3.1 動(dòng)物模型的建立

大鼠因其價(jià)廉、易飼養(yǎng)、變量可控性好、骨骼系統(tǒng)的解剖結(jié)構(gòu)和骨代謝與人類極為相似而被用于骨代謝的研究[9]。有學(xué)者[10]報(bào)告：70 kg體重的成人每天吸20支煙，攝入尼古丁的量約為0.15～0.18 mg·kg-1。根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[9]提供的人與動(dòng)物間表面積折

算的等效劑量比值，大鼠與人的比值為56.0，據(jù)此推算200 g大鼠用量約為人用量的1/6，經(jīng)換算，此量相當(dāng)于1人每天吸15支煙的尼古丁含量。侯秀敏等[11]對(duì)6周齡Wistar大鼠（160～180 g）進(jìn)行被動(dòng)吸煙2個(gè)月，結(jié)果表明煙草煙霧下調(diào)牙槽骨內(nèi)牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1的表達(dá)，認(rèn)為影響牙槽骨礦化?；诖笫蟮纳硖匦?，本實(shí)驗(yàn)選擇5周齡Wistar大鼠（120～140 g）為研究對(duì)象，腹腔注射尼古?。刻?.73 mg·kg-1）3個(gè)月，觀察尼古丁對(duì)大鼠牙槽骨內(nèi)和頜骨內(nèi)鈣磷含量以及ALP活性的差異影響。

3.2 正常大鼠牙槽骨內(nèi)和頜骨內(nèi)鈣磷含量、ALP活

性及兩部位間的差異表現(xiàn)

在骨的發(fā)生學(xué)上，牙槽骨和頜骨的形成均是膜內(nèi)成骨，在即將成骨的部位由間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[6-7]。成骨細(xì)胞通過基質(zhì)小泡釋放鈣離子和ALP等酶類物質(zhì)，鈣離子在ALP作用下沉積在膠原纖維絲上，完成基質(zhì)的礦化過程，最后形成礦化的骨小梁和平行的內(nèi)、外板。骨組織化學(xué)成分的含量和結(jié)構(gòu)受多種因素的影響，但鈣磷含量比例基本一致，骨的鈣/磷比值平均為2.33。在骨的組織結(jié)構(gòu)上，牙槽骨疏松多孔，呈非均質(zhì)性[12]；下頜升支頰側(cè)皮質(zhì)

骨較舌側(cè)厚，松質(zhì)骨于升支中份厚度最大，部分下頜升支無松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組

牙槽骨內(nèi)鈣磷總含量約占其重量的42%，鈣/磷比值為2.36，ALP活性為1.679；頜骨內(nèi)鈣磷總含量約占其重量的41%，鈣/磷比值為2.39，ALP活性為1.170。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠牙槽骨內(nèi)鈣磷含量和頜骨內(nèi)鈣磷含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），牙槽骨內(nèi)ALP活性與頜骨內(nèi)ALP活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示：在本實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，健康大鼠

牙槽骨內(nèi)鈣磷含量略低于頜骨內(nèi)鈣磷含量，ALP活性高于頜骨內(nèi)ALP活性，此結(jié)果可能與牙槽骨內(nèi)松質(zhì)骨含量較多、局部機(jī)械刺激等促進(jìn)骨代謝有關(guān)。

3.3 尼古丁對(duì)不同部位骨內(nèi)鈣磷含量和ALP活性的

影響

Levin等[14]通過流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)吸煙者牙槽骨的密度和高度明顯低于非吸煙者。劉潁鳳等[12]研究

表明尼古丁使鼠牙槽骨高度輕度降低并呈劑量依賴性，CT掃描發(fā)現(xiàn)骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度的值與尼古丁給藥劑量呈負(fù)相關(guān)，骨小梁間隙值高于對(duì)照組。Kim等[15]研究發(fā)現(xiàn)隨著尼古丁濃度的增加，礦化結(jié)節(jié)形成顯著減少；低濃度時(shí)ALP活性與對(duì)照組無明顯差異，隨濃度的增加，ALP活性隨之降低。研究[4]指出低濃度的尼古丁促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖并提高ALP活性，促進(jìn)Ⅰ型膠原的合成，但高濃度時(shí)則抑制細(xì)胞的增殖和骨的代謝。研究[4-5]還表明尼古丁參與成骨細(xì)胞的分化是由于尼古丁導(dǎo)致細(xì)胞膜的除極化，繼而結(jié)合煙堿受體，激活電位依賴的Ca2+通道，通過鈣離子信號(hào)途徑而完成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在本實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組大鼠牙槽骨和頜骨內(nèi)鈣磷含量明顯減少（P<0.05），ALP活性無顯著性差異（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組大鼠牙槽骨和頜骨內(nèi)鈣磷含量和ALP活性均無明顯差異（P>0.05）。結(jié)果顯示尼古丁均下調(diào)牙槽骨和頜骨鈣磷含量，卻沒有明顯影響ALP活性，此結(jié)果可能與尼古丁濃度和實(shí)驗(yàn)周期有關(guān)。筆者推測(cè)尼古丁對(duì)成骨細(xì)胞的抑制作用并非完全通過降低ALP活性完成，可能通過鈣化相關(guān)的非膠原蛋白參與完成。因此尼古丁對(duì)骨形成影響的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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（本文采編 王晴）