孟賀　丁潔　李任　梁銳英　吳文慧

[摘要] 目的 研究4種不同牙科金屬材料（金合金、銀鈀合金、鈷鉻合金、鎳鉻合金）浸提液對小鼠成纖維細(xì)胞

L929凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響。方法 以金合金（A組）、銀鈀合金（B組）、鈷鉻合金（C組）、鎳鉻合金（D組）的浸提液體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞L929，并以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基作為陰性對照（E組）。采用逆轉(zhuǎn)

錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測了4種牙科金屬材料浸提液對L929細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase-3、8、9 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 4種牙科金屬材料浸提液培養(yǎng)小鼠L929細(xì)胞48 h后，除A組與E組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，各組間caspase-3 mRNA及caspase-9 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組間caspase-8 mRNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除A組與C組、B組與D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，caspase-3及caspase-9蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組間caspase-8蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 4種牙科金屬材料，除金合金外，均誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞L929凋亡相關(guān)基因表達(dá)增加，金屬離子可能通過線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 牙科金屬； 浸提液； 成纖維細(xì)胞L929； 凋亡； 免疫組織化學(xué)

[中圖分類號] R 783.1 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.007

目前牙科合金材料的的強(qiáng)度、硬度、韌性和耐磨性等力學(xué)性能比較優(yōu)越，已經(jīng)成為口腔臨床中重要的修復(fù)材料。按照組成合金主要元素的價(jià)值可以分為貴金屬合金和非貴金屬合金兩大類[1-2]。應(yīng)用于口腔中的貴金屬合金（如金合金等）和非貴金屬合金（如鎳鉻合金等）在細(xì)胞水平上均顯示出良好的生物相容性。然而，口腔環(huán)境復(fù)雜且金屬修復(fù)體在口腔環(huán)境中行使功能是一個長期的過程，口腔微生物可以通過多種途徑對材料產(chǎn)生腐蝕[3]。材料腐蝕可引起金屬離子釋放，如釋放的金屬離子達(dá)到一定的濃度后可能會導(dǎo)致局部或全身的損害[4]。有研究顯示金合

金離子析出量相對較少，耐腐蝕性能相對較好；而鎳鉻合金的耐腐蝕性能尚不夠理想，鎳離子可以改變牙齦成纖維細(xì)胞的形態(tài)、生存和增殖能力[5-6]。因此，生物相容性在義齒的材料選擇中將越來越受到重視。從整體、細(xì)胞和分子水平上評價(jià)材料的生物相容性是生物材料評價(jià)的發(fā)展趨勢和最終目的[7]。

本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse trans-cription-polymerase chain reaction，RT-PCR）及免疫組化的方法在分子水平上對4種牙科合金（金合金、銀鈀合金、鈷鉻合金、鎳鉻合金）材料浸提液培養(yǎng)48 h的L929細(xì)胞天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（cas-

pase）-3、8、9 mRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，在分子水平上探討金屬離子與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

小鼠成纖維細(xì)胞L929由中國醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑和儀器

RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胎牛血清（TBD公司，天津），RT-PCR試劑盒（TAKARA公司，日本），總RNA提取劑（杭州博日公司），二甲基亞砜

（AMRESCO公司，美國），兔抗鼠caspase-3多克隆抗

體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（北京博奧森公

司），免疫組化試劑盒（PV6001，北京中杉金橋有限

公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（HERA Cell 150，Heraeu公司，

德國），高速離心機(jī)（DUPONT公司，美國），倒置相

差顯微鏡（Olympus公司，日本），恒溫水浴鍋（Grant

公司，英國），聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reac-

tion，PCR）儀（Biometra公司，德國），電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及浸提液制備

將實(shí)驗(yàn)材料分為金合金（A組）、銀鈀合金（B組）、鈷鉻合金（C組）、鎳鉻合金（D組）4個實(shí)驗(yàn)組，每組樣

本量均為8個。4種牙科合金的組成見表1。制作半徑為5 mm、厚為1 mm的圓形蠟片，根據(jù)不同合金的要求鑄造形成圓形金屬片，打磨拋光后超聲清洗15 min，

去離子水沖洗數(shù)遍后置于玻璃小瓶中，將金屬片于121 ℃高壓滅菌后置于24孔板中。每孔加2 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時設(shè)立陰性對照組（E組，即2 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液），在37 ℃、5%CO2條件下連續(xù)浸提7 d后待用[8]。

1.4 RT-PCR檢測caspase-3、8、9 mRNA的表達(dá)

4種牙科金屬材料浸提液及E組培養(yǎng)液培養(yǎng)對數(shù)生長期的L929細(xì)胞48 h，按BIOZOL說明書提取RNA。依照小鼠GAPDH與caspase-3、8、9 的cDNA序列，采用Primer Premier 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物序列（表2）。按RT-PCR試劑盒操作說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42 ℃ 30 min、99 ℃ 5 min、5 ℃ 5 min。PCR中caspase-3和caspase-8的復(fù)性溫度為55 ℃，caspase-9的復(fù)性溫度為58 ℃。取PCR產(chǎn)物5 μL與Genefinder和6×Loading buffer預(yù)染液1 μL混合后，上樣于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳液為1×TAE，電壓為100 V，40 min后在紫外燈凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，分析灰度值。

1.5 免疫組化反應(yīng)檢測caspase-3、8、9蛋白表達(dá)

將對數(shù)生長期的L929細(xì)胞以濃度為每毫升6×104個接種于放有蓋玻片的6孔板，24 h細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，加入不同浸提液培養(yǎng)48 h。棄上清液，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3，95%乙醇室溫固定10 min，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。取出細(xì)胞爬片，晾干，用中性樹膠黏于載玻片上，PBS沖洗細(xì)胞爬片，3%過氧化氫室溫靜止10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加入0.3%Triton-100，室溫30 min，增加細(xì)胞的通透性，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加50 μL一抗（1∶200），陰性對照用PBS代替一抗，放置于濕盒中4 ℃過夜，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加50 μL的二抗，室溫孵育40 min，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加DAB溶液顯色3 min。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染3 min，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗10 min，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察并拍攝照片。每張切片隨機(jī)選取3個視野，caspase-3、8、9在細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色染色為陽性表達(dá)，以細(xì)胞未著色或輕微著色為陰性。在高倍鏡（×400）下拍攝照片，

應(yīng)用Image Pro Pluss 6.0圖像分析系統(tǒng)測平均光密度（optical density，OD）值，對各組切片的caspase-3、8、9表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，對caspase-3、8、9 mRNA及蛋白的表達(dá)進(jìn)行單因素方差分析及最小顯著差異（least signi-ficant difference，LSD-t）檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測結(jié)果

5組L929細(xì)胞caspase-3、8、9 mRNA凝膠電泳結(jié)果見圖1，相對灰度值（各組灰度值與GAPDH灰度值比值）的測量結(jié)果見表3。采用單因素方差方法分析各組灰度值，結(jié)果顯示caspase-3 mRNA與caspase-9 mRNA的表達(dá)差異顯著（F值分別為156.337、100.216，P<0.05）；LSD-t檢驗(yàn)顯示除A組與E組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組間差異顯著（P<0.05）。各組cas-pase-8 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.880，P>

0.05）。

2.2 免疫組化檢測結(jié)果

各組OD值的檢測結(jié)果見表4。由表4可見，cas-pase-3蛋白及caspase-9蛋白的表達(dá)差異顯著（F值分別為195.05、745.83，P<0.05）；LSD-t檢驗(yàn)顯示除A組與C組、B組與D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組間差異顯著（P<0.05）。caspase-8蛋白表達(dá)差異無

統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.593，P>0.05）。B組和D組caspase-3和caspase-9呈陽性表達(dá)，各組caspase-8呈陰性表達(dá)（圖2～4）。

3 討論

牙科合金修復(fù)體長期處在唾液這一電解質(zhì)環(huán)境中會發(fā)生不同程度的腐蝕，導(dǎo)致金屬離子析出。如果這些離子超過一定的濃度，將對細(xì)胞造成損害。材料與機(jī)體短期或長期的接觸而導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化是以往評價(jià)材料生物相容性的主要內(nèi)容和方法。如果生物材料對機(jī)體的影響已經(jīng)在整體水平和細(xì)胞水平上表現(xiàn)出來，那么在分子水平的基因表達(dá)方面勢必已經(jīng)造成影響，并且會極靈敏地反映出來。對于修復(fù)體材料析出的金屬離子可能對口腔細(xì)胞和組織形成不良刺激的問題在醫(yī)學(xué)界已基本達(dá)成共識，但直至2003年Faccioni等[9]和2004年Cortizo等[10]的研究報(bào)道揭示了修復(fù)體中析出金屬離子對口腔黏膜細(xì)胞和成骨樣細(xì)胞的DNA損傷和誘導(dǎo)凋亡作用，人們才開始在分子水平上探討金屬離子造成口腔組織不良刺激反應(yīng)的作用機(jī)制。有研究[11-12]顯示：金屬離子

引起細(xì)胞死亡的方式主要是凋亡，有濃度依賴性和時間依賴性。caspases家族是細(xì)胞凋亡過程中的必需要素，caspase-3為caspase家族中的凋亡執(zhí)行因子，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶之一。正常情況下，胞質(zhì)中caspase-3以單體、微量、無或低活性的前caspase-3形式存在，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，其變?yōu)橛谢钚缘腸aspase-3。caspase-8與caspase-9分別參與死亡受體通路誘導(dǎo)的凋亡和線粒體通路誘導(dǎo)的凋亡。以往研究[13]表明4種牙科合金的細(xì)胞毒性為0級，均顯

示出良好的生物相容性。本研究在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)4種牙科合金caspase-3 mRNA與caspase-9 mRNA表達(dá)水平在各組間差異顯著，在免疫組化實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)4種牙科合金caspase-3與caspase-9蛋白表達(dá)水平差異顯著，其中金合金與鈷鉻合金差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，鎳鉻合金與銀鈀合金差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。牙科合金引起細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化差異，可能是由于在口腔這一復(fù)雜的電解質(zhì)環(huán)境中，不同合金的化學(xué)穩(wěn)定性不同所致。目前對鎳的致敏性和致癌性已有比較趨于一致的認(rèn)識[14]。以往的研究[15-16]

表明：鎳離子可導(dǎo)致DNA的合成與復(fù)制受到抑制、改變DNA結(jié)構(gòu)、降低蛋白質(zhì)合成并影響堿性磷酸酶活性等一系列生物效應(yīng)，鎳鉻合金可以導(dǎo)致DNA損傷并引起細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，D組caspse-3 mRNA及蛋白表達(dá)均增高。雖然銀鈀合金為半貴金屬材料，但鈀能和氯、硫等反應(yīng)，形成氯化物和硫化物，這種以離子形式存在的鈀能引起不良的生物學(xué)反應(yīng)[17]。另外，關(guān)于鈀的致敏性和致癌性也有報(bào)道[18]。本研

究中發(fā)現(xiàn)銀鈀合金對caspase-3及caspase-9基因及蛋白表達(dá)的影響與金合金及陰性對照組差異顯著，其

中對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與鎳鉻合金無明顯差異。相反，鈷鉻合金作為非貴金屬材料對caspase-3及caspase-9基因的表達(dá)僅次于金合金及陰性對照組，而對caspase-3及caspase-9蛋白表達(dá)的影響與金合金及陰性對照組無顯著差異?？赡苁怯捎谄洳缓墟囋囟休^高比例的鉻元素，鉻元素的增加可減少金屬離子的析出，減少細(xì)胞毒性，并且在鈷鉻合金的表面可以形成Cr-O和Cr-OH結(jié)構(gòu)的鈍化膜，阻止鈷和鉻的析出[19]。

細(xì)胞凋亡是一個精細(xì)的調(diào)節(jié)過程，本研究發(fā)現(xiàn)4種牙科合金在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)caspase-3及caspase-9 mRNA表達(dá)增高，并且各組間差異顯著。在翻譯水平上金合金與鈷鉻合金未發(fā)現(xiàn)對caspase-3及caspase-9蛋白的表達(dá)有顯著誘導(dǎo)作用，而銀鈀合金與鎳鉻合金誘導(dǎo)caspase-3及caspase-9蛋白表達(dá)增高，這與轉(zhuǎn)錄水平上的結(jié)果并不完全一致。可能還存在其他抑制凋亡蛋白表達(dá)的途徑或通路同時發(fā)揮作用。唾液環(huán)境復(fù)雜，金屬離子在培養(yǎng)基中的情況也不能完全代表在唾液中的真實(shí)情況，這些問題都需要進(jìn)一步研究。另外，各組間caspase-8 mRNA及蛋白表達(dá)均無顯著差異，進(jìn)一步提示金屬離子可能通過線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。希望這一現(xiàn)象能為將來在分子水平上檢測材料的生物相容性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯 杜冰）