李云飛，戴前穎*，夏濤，高麗萍，孟 菲

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥230036）

優(yōu)質(zhì)綠茶飲料湯色黃綠明亮，然而受光照、氧氣、溫度影響，綠茶飲料逐漸變黃、變紅，甚至變褐，發(fā)生色澤劣變現(xiàn)象，影響產(chǎn)品的貨架期和外觀質(zhì)量。近年來(lái)，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外茶葉工作者開(kāi)始嘗試用數(shù)理分析解釋內(nèi)含物與感官品質(zhì)的關(guān)系。Kunbo Wang等通過(guò)對(duì)龍井、烏龍進(jìn)行外觀審評(píng)，將得到的分?jǐn)?shù)與兒茶素、葉綠素、揮發(fā)性物質(zhì)、氨基酸進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，龍井茶湯的色澤分?jǐn)?shù)與葉綠素a和葉綠素b極顯著相關(guān)，與EGC顯著相關(guān)(r=0.499，P<0.01)。烏龍茶湯的色澤分?jǐn)?shù)與總兒茶素、EGC、C和游離氨基酸顯著相關(guān) (r=0.384～0.965,P<0.01)[1，2]。徐文平選取咖啡堿、EGCG以及蘆丁作為研究對(duì)象，與感官審評(píng)中得到的苦澀味強(qiáng)度進(jìn)行相關(guān)性分析[3]。龔淑英等分析了普洱在貯藏期間茶多酚、可溶性糖、氨基酸含量的變化與感官品質(zhì)的相關(guān)性[4]。

然而多數(shù)研究均是基于感官審評(píng)，而感官審評(píng)既受環(huán)境因素制約，更受評(píng)審人員審評(píng)條件和閱歷的影響，因此無(wú)法完全做到標(biāo)準(zhǔn)化和客觀性。色差計(jì)是一種更加客觀與科學(xué)的顏色測(cè)量?jī)x器，陸建良對(duì)29個(gè)綠茶、20個(gè)烏龍茶和15個(gè)紅茶樣品進(jìn)行了色差參數(shù)分析和感官審評(píng)。結(jié)果表明，茶類間色差參數(shù)差異顯著，并與感官評(píng)分具有相關(guān)性[5]。李立祥研究得出了相似結(jié)果并認(rèn)為色差的衍生指標(biāo)a/b可以在很大程度上反映綠茶湯色的優(yōu)劣[6]。

本文利用色差計(jì)檢測(cè)了5種綠茶茶湯在40℃貯藏12 d的條件下色澤變化，并跟蹤檢測(cè)了其主要內(nèi)含物成分變化，利用SPSS軟件對(duì)各主要化學(xué)成分與色差參數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析，研究茶湯在貯藏過(guò)程中，化學(xué)成分變化與湯色劣變的關(guān)系。從而對(duì)揭示茶湯色澤的變化規(guī)律，選擇合理的護(hù)色方案，完善綠茶飲料加工工藝具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器

試驗(yàn)材料：綠茶炒青、瓜片、黃芽、毛峰、龍井購(gòu)自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶廠。茶葉用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩網(wǎng)后，作為供試茶樣。

試劑配制：

（1）pH8.0磷酸鹽緩沖液：配制1/15mol/L磷酸氫二鈉和1/15mol/L磷酸二氫鉀溶液。然后取1/15 mol/L的磷酸氫二鈉溶液95mL和1/15mol/L磷酸二氫鉀溶液5mL，混勻。

（2）2%茚三酮溶液：稱取水合茚二酮（純度不低于99%）2 g，加50mL水和80mg氯化亞錫（SnCl·2H2O）攪拌均勻。分次加少量水溶解，放在暗處，靜置一晝夜，過(guò)濾后加水定容至100mL。

（3）蒽酮：稱取100mg蒽酮溶于100mL 98%硫酸溶液中，用時(shí)配制。

超純水為杭州娃哈哈飲用水。實(shí)驗(yàn)用的甲醇、乙腈和乙酸為色譜級(jí)的試劑，購(gòu)于Tedia公司（USA）。

主要儀器：日本SHIMADZULC-20AD高效液相色譜儀、SPD6AV可調(diào)波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器（日本島津公司）、LC-solution色譜工作站、UV-2800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (上海尤尼柯儀器有限公司)、Minolta CM-3500D型色彩色差儀（日本柯尼卡美能達(dá)公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

茶湯的制備：將供試茶樣按1.0 g:100mL茶水比于85℃水浴中提取15min，期間攪拌數(shù)次。茶湯冷卻后，用定量濾紙抽濾，700W微波殺菌3min[7]，置于40℃培養(yǎng)箱，每3 d檢測(cè)色差和總糖、游離氨基酸、兒茶素、咖啡堿、黃酮醇含量。

總糖總量：蒽酮比色法[8]。

游離氨基酸含量檢測(cè)：茚三酮比色法[9]。

兒茶素含量檢測(cè):利用島津LC-20AD高效液相色譜儀（HPLC，配SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器），檢測(cè)條件為：phe-nomenex-C18(300mm×4.60mm)柱，流動(dòng)相A相：1%乙酸水溶液，B相：100%乙腈。洗脫梯度為：20min內(nèi)A相從90%降到87%，B相從10%升到13%；20～40min內(nèi)A相從87%降到70%，B相從13%升到30%；40～55min內(nèi)A相從70%升到90%，B相從30%降到10%。流速：1mL/min，柱溫：30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，每次進(jìn)樣量20μL，保留時(shí)間90min.

咖啡堿含量檢測(cè)：方法同兒茶素檢測(cè)方法。

黃酮醇含量檢測(cè)：方法同兒茶素檢測(cè)方法，檢測(cè)波長(zhǎng)為345nm。

色差檢測(cè)方法：采用Minolta CM-3500D型色差儀，對(duì)處理樣品的色度值L、a、b進(jìn)行測(cè)定。

茶湯中黃酮醇類化合物的定性檢測(cè)，LC/ESI-TOF-MS條件，離子化模式為大氣壓電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子模式；源電壓3.5 kV；碰撞電壓:15～20V；殼氣 50psi；氮?dú)饬魉?12mL/min；加熱細(xì)管溫度300℃；流速:0.4mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng):345 nm。

數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)：本文利用SPSS 18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究色差參數(shù)與主要化學(xué)組分之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏期間茶湯色差參數(shù)的變化

表1系5種茶湯的色差參數(shù)變化，在0d時(shí)，所有茶湯明亮度相似；瓜片、黃芽綠度最好，毛峰與龍井次之，炒青較差；黃度方面瓜片、龍井最大，毛峰和炒青次之，黃芽較低。在儲(chǔ)存的過(guò)程中，茶湯的L值隨著貯藏天數(shù)的增加不斷下降，到12d時(shí)下降了34%～43%；a、b值不斷上升，在感官上表現(xiàn)為明亮度下降，渾濁度上升，茶湯的色澤變紅，變褐。

2.2 貯藏期間茶湯化學(xué)成分變化

2.2.1 貯藏期間氨基酸和總糖的變化

氨基酸與糖類物質(zhì)被認(rèn)為在一定溫度下會(huì)發(fā)生非酶褐變，生成棕色甚至是黑色的大分子物質(zhì)類黑精或稱擬黑素[10]，研究?jī)烧吆孔兓瘜?duì)辨別茶飲料在貯藏過(guò)程中美拉德反應(yīng)對(duì)茶湯色澤的影響有著重要作用。表2、表3分別為儲(chǔ)存期茶湯中氨基酸和總糖含量的變化。從表中可以看出，茶湯中氨基酸在儲(chǔ)存期間有先上升再下降的趨勢(shì)，這可能是隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，在氨基酸氧化、降解的同時(shí)，有部分水溶性蛋白質(zhì)水解成氨基酸所致[11]；而總糖變化幅度則不是很明顯，趨勢(shì)也不是很清晰。

表1 各種茶湯在貯藏過(guò)程中的色差參數(shù)

2.2.2 貯藏期間咖啡堿和兒茶素的變化

表2 茶湯氨基酸含量變化 （mg/mL）

雖然兒茶素本身無(wú)色，不是茶湯的呈色物質(zhì)，但兒茶素的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)茶湯色澤劣變產(chǎn)生影響。兒茶素易氧化、聚合、縮合，在空氣中可以自動(dòng)氧化成黃棕色物質(zhì)[12]。圖1為0d時(shí)五種茶湯咖啡堿以及兒茶素HPLC圖譜。將檢測(cè)出兒茶素和咖啡堿含量變化列于表4?？梢园l(fā)現(xiàn)表型兒茶素在貯藏的過(guò)程中下降明顯，而非表型兒茶素由于在發(fā)生氧化及脫沒(méi)食子酸反應(yīng)的同時(shí)[13]，表型兒茶素還會(huì)發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)生成非表型兒茶素[14]，在貯藏過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)增加的現(xiàn)象。

表3 儲(chǔ)存期茶湯總糖含量變化（mg/mL）

表4 儲(chǔ)存期茶湯中咖啡堿與兒茶素含量變化（峰面積）

表5 主要黃酮醇類化合物的光譜特征和分子量

表6 儲(chǔ)存期茶湯中黃酮醇類物質(zhì)含量變化 （峰面積）

2.2.3 貯藏期間黃酮醇類物質(zhì)的變化

黃酮醇在茶葉中多與糖形成黃酮醇苷類物質(zhì)，占茶葉干重的3%～4%，多為亮黃色，其氧化產(chǎn)物為橙黃以致棕紅，與綠茶湯色關(guān)系較大[15]。茶湯中的黃酮醇類化合物的種類很多[16]，目前尚無(wú)法準(zhǔn)確定量茶湯中的黃酮醇類化合物。本實(shí)驗(yàn)室參考Lin L.Z的方法，采用液相質(zhì)譜（LC/ESI-TOF-MS）結(jié)合現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性[17]，對(duì)茶湯中黃酮醇類化合物進(jìn)行分析，分離檢測(cè)到10個(gè)黃酮醇苷的物質(zhì)峰（圖2），并鑒定出8個(gè)峰，分別為楊梅素、槲皮素、山奈素的糖苷類化合物，如表5所示。

表6為儲(chǔ)存期茶湯中黃酮醇類物質(zhì)含量變化，從表中可以看出不同茶湯黃酮醇類物質(zhì)起始值差別很大，瓜片和毛峰的黃酮醇類物質(zhì)含量較大，而炒青和龍井黃酮醇類物質(zhì)含量較少[18]。

在儲(chǔ)存期間，黃酮醇類物質(zhì)變化區(qū)別較大，峰1、2變化趨勢(shì)不明顯，峰 3、4、9、10出現(xiàn)下降，而其它峰有先增加再下降的趨勢(shì)。其中，黃酮醇單糖苷變化速度較快（峰3、4），而黃酮醇三糖苷由于配糖化作用，反應(yīng)速度較慢[19]。

2.3 相關(guān)分析

利用SPSS 18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究色差參數(shù)與茶湯主要化學(xué)組分之間的相關(guān)性，結(jié)果列于表7，結(jié)果表明，兒茶素類如EGCG、EC、C、GCG、ECG與色澤相關(guān)性十分顯著，特別是EGCG與明亮度（L）、紅綠度（a）、黃度（b）、a/b值均存在極其顯著相關(guān)性；此外黃酮醇單糖苷（峰3楊梅素半乳糖糖苷，峰4楊梅素葡萄糖苷）與L值、紅綠度（a）、a/b均極顯著相關(guān)；而其他黃酮醇類化合物以及氨基酸、總糖、咖啡堿與色差參數(shù)相關(guān)性則不明顯。表明茶湯在貯藏期間，兒茶素和黃酮醇單糖苷是影響茶湯劣變的重要指標(biāo)。

表7 茶湯主要化學(xué)組分與色差參數(shù)的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

茶飲料是一種高濃度溶液，化學(xué)成分繁多，反應(yīng)體系復(fù)雜，在貯藏過(guò)程中化學(xué)物質(zhì)對(duì)茶飲料的色澤產(chǎn)生影響既有獨(dú)立影響，也有共同影響。近年來(lái)茶葉工作者普遍認(rèn)為茶湯色澤與兒茶素、黃酮醇類化合物以及美拉德反應(yīng)聯(lián)系緊密。但是從本文得到的結(jié)果來(lái)看，茶湯中氨基酸與總糖含量的變化與色澤并無(wú)明顯的相關(guān)性，說(shuō)明茶湯在40℃下貯藏，美拉德反應(yīng)并不是茶湯色澤劣變的主要因素；而兒茶素特別是EGCG與茶湯色澤極顯著相關(guān)，佐證了兒茶素聚合氧化，會(huì)對(duì)茶湯色澤產(chǎn)生重要影響。此外兩個(gè)楊梅素單糖苷與色澤也有著極顯著的相關(guān)性，進(jìn)一步證實(shí)了朱博的觀點(diǎn)：貯藏期綠茶茶湯的三個(gè)主要黃酮醇（楊梅素、槲皮素、山萘素）都與色澤有一定的相關(guān)性，楊梅素苷類與綠茶茶湯色澤的關(guān)系最密切[20]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明綠茶在儲(chǔ)存期間，兒茶素和黃酮醇類化合物與色澤關(guān)系緊密，為下一步研究其劣變機(jī)理打下了基礎(chǔ)，確定了方向。但是必須認(rèn)識(shí)到，茶飲料組分復(fù)雜，本文僅選取幾種主要研究熱點(diǎn)的組分進(jìn)行分析，不能完全揭示和解釋茶飲料劣變的原因，以及兒茶素在茶飲料這個(gè)復(fù)雜體系中氧化的機(jī)理，是否與其他物質(zhì)發(fā)生協(xié)同影響，這都是需要進(jìn)一步研究的。

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