項丹，姜藻，顧曉怡

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院腫瘤中心，江蘇南京 210009;2.東南大學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室，江蘇南京 210009)

近年來乳腺癌發(fā)生率呈明顯上升趨勢，其中不表達(dá)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和表皮生長因子受體-2(HER-2)的乳腺癌被稱為“三陰性”乳腺癌［1-2］，是目前乳腺癌治療的難點之一［3-4］。Basal-like型細(xì)胞絕大多數(shù)不表達(dá)這3種受體，因此常作為研究“三陰性”乳腺癌的靶細(xì)胞［5］。目前的研究結(jié)果僅能提示鉑類、蒽環(huán)類、高劑量環(huán)磷酰胺等可能是相對敏感藥物［6］，而紫杉類和長春新堿類藥物是不敏感藥物，但不能明確三陰乳腺癌的最佳治療策略［6-7］。

西達(dá)本胺是我國自主研發(fā)的一種組蛋白去乙?；敢种苿壳把芯勘砻髌淇梢种平Y(jié)腸癌、前列腺癌、淋巴瘤等細(xì)胞的增殖，但其對三陰乳腺癌的作用尚未見報道。本實驗通過西達(dá)本胺和(或)順鉑(DDP)干預(yù)Basal-like型細(xì)胞，初步探討西達(dá)本胺聯(lián)合順鉑體外干預(yù)三陰乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231增殖、凋亡及其機制，探索治療三陰乳腺癌的新方法。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人三陰乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，培養(yǎng)傳代在含體積分?jǐn)?shù)為10%新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.2 藥物及主要試劑

順鉑購自山東齊魯制藥廠，西達(dá)本胺由深圳微芯公司贈送，用二甲亞砜(DMSO)溶解，配成32 000 μmol·L-1的儲存液，保存于-20℃冰箱中，3周內(nèi)使用，控制DMSO濃度在1%以內(nèi)。DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青有限公司)，HEPES、DMSO、MTT(美國 Sigma 公司)，Anti-ERCC1 antibody、Anti-HDAC3 antibody、Anti-Histone H3 antibody-ChIP Grade(美國Abcam公司)

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT法檢測西達(dá)本胺及順鉑單獨對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 將MDA-MB-231細(xì)胞密度調(diào)整為4.5 ×104ml-1，接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔200 μl，培養(yǎng)過夜，觀察細(xì)胞貼壁且生長良好后，取西達(dá)本胺藥物濃度 4、8、16、32、64、128 μmol·L-1，DDP 藥物質(zhì)量濃度 1、2、4、8、16、32 mg·L-1處理作為實驗組，非藥物處理作為陰性對照，DMEM培養(yǎng)液不加細(xì)胞作為空白對照，各設(shè)3個復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入 5 mg·ml-1MTT 溶液 20 μl，培養(yǎng) 4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加 DMSO 150 μl，搖床振蕩 5 min，酶標(biāo)儀測定492 nm波長處OD值。以藥物作用濃度為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)繪制腫瘤增殖抑制曲線圖，并計算出IC50值。

1.3.2 MTT法檢測西達(dá)本胺及順鉑聯(lián)合對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 以1/2 IC50西達(dá)本胺+1/16、1/8、1/4、1/2、1、2 IC50順鉑作用于細(xì)胞，并計算出達(dá)到IC50時順鉑的濃度。

1.3.3 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測西達(dá)本胺對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響 將MDA-MB-231細(xì)胞密度調(diào)整為4.5×104ml-1，接種于6孔板，每孔4 ml，分別以1/4 IC50、1/2 IC50和IC50濃度的西達(dá)本胺處理細(xì)胞48 h，對照組加入含等量DMSO的DMEM培養(yǎng)液，用不含EDTA的胰酶消化收集處理后的MDA-MB-231細(xì)胞，4℃PBS緩沖液洗滌2次，加入500 μl結(jié)合緩沖液、5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI，染色 5 ～15 min 后，用流式細(xì)胞儀及ModFit軟件檢測分析。

1.3.4 Western blotting分析組蛋白H3、HDAC3蛋白的表達(dá) 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%，分別取IC50西達(dá)本胺、1/2 IC50西達(dá)本胺處理及對照組細(xì)胞各5×106個，加裂解液(含蛋白酶抑制劑)冰上裂解 30 min，14 000 r·min-1離心 5 min，取上清，BCA法測定蛋白含量。蛋白與5倍上樣緩沖液混合煮沸5 min后，取20 μg蛋白上樣，進行SDSPAGE，轉(zhuǎn)膜并封存。50 g·L-1的脫脂奶粉/TBST按1∶1 000稀釋一抗，4℃孵育過夜，再加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗4℃孵育2 h，然后加入ECL液，曝光，顯影，定影。

1.3.5 熒光定量PCR檢測ERCC1基因表達(dá)情況分別取IC50西達(dá)本胺、IC50順鉑及1/2 IC50西達(dá)本胺+1/2 IC50順鉑處理48 h及對照組細(xì)胞5×106個，采用Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用羅氏SYBR染料進行熒光定量PCR，行數(shù)據(jù)分析。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min;94℃變性15 s，54℃或者58℃退火20 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。ERCC1上下游引物分別為5'-TGGCTTCTGCTATGTCAACG-3'和5'-GCACGTGGGTTG GTAGAAGT-3'，產(chǎn)物大小為216 bp;內(nèi)參β-actin上下游引物分別為5'-AGATACTAATGCTCTGCGTGT-3'和5'-GATGGAGACTGGCTTCTGATT-3'，產(chǎn)物大小為 147 bp。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 西達(dá)本胺、順鉑單藥對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用

與未經(jīng)藥物處理的正常對照組比較，細(xì)胞經(jīng)過不同濃度不同時間的處理后細(xì)胞增殖受到明顯抑制，不同濃度及不同時間細(xì)胞增殖存在明顯差異(P＜0.05)，見圖1、2。西達(dá)本胺作用24、48、72 h 的 IC50分別是(84.36 ±4.33)、(57.38 ±7.19)、(31.64 ±9.25)μmol·L-1，順鉑作用24、48、72 h 的IC50分別是(18.24 ±1.14)、(8.37 ±0.79)、(5.08 ±1.63)mg·L-1。單藥西達(dá)本胺濃度64 μmol·L-1、單藥順鉑質(zhì)量濃度 8 mg·L-1接近 48 h的IC50值，遂取其為后續(xù)實驗濃度。

圖1 西達(dá)本胺對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Influence of chidamide on the proliferation of MDAMB-231 cells

圖2 順鉑對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響Fig 2 Influence of cisplatin on the proliferation of MDA-MB-231 cells

2.2 西達(dá)本胺聯(lián)合順鉑對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用

32 μmol·L-1西達(dá)本胺聯(lián)合不同濃度的順鉑(0.5、1、2、4、8、16 mg·L-1)對 MDA-MB-231 細(xì)胞作用48 h后，抑制率分別為(23.04±4.73)%、(37.45±5.14)%、(49.47±3.72)%、(60.33±4.05)%、(76.64±3.58)%、(89.14±6.12)%，計算出順鉑的 IC50為(1.97±0.24)mg·L-1，此數(shù)值明顯小于 1/2 IC50順鉑，表明西達(dá)本胺聯(lián)合順鉑能起到協(xié)同作用。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

西達(dá)本胺作用48 h后，16 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率為48.5%，32 μmol·L-1組凋亡率為 70.1%，64 μmol·L-1組凋亡率為89.9%，而對照組細(xì)胞自然凋亡率為16.4%，說明該藥物具有明顯的促細(xì)胞凋亡作用。3個濃度西達(dá)本胺組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 西達(dá)本胺作用MDA-MB-231細(xì)胞48 h的細(xì)胞凋亡Fig 3 Apoptosis of MDA-MB-231 cells treated with chidamide for 48 h

2.4 不同濃度西達(dá)本胺對組蛋白H3、HDAC3蛋白表達(dá)的影響

Western blotting 法檢測顯示，對照組和 32、64 μmol·L-1西達(dá)本胺作用48 h后隨著藥物濃度的增加，H3的乙?；皆鰪?，HDAC3蛋白表達(dá)減少，見圖4。表明西達(dá)本胺可通過抑制HDAC3蛋白的表達(dá)，上調(diào)組蛋白H3的乙酰化水平，影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

圖4 西達(dá)本胺作用48 h后H3、HDAC3蛋白表達(dá)水平Fig 4 The expression of H3 and HDAC3 of MDA-MB-231 cells treated with chidamide for 48 h

2.5 熒光定量PCR檢測ERCC1基因表達(dá)情況

熒光定量PCR結(jié)果顯示，單獨使用順鉑組細(xì)胞ERCC1與對照組表達(dá)量相近，但單獨使用西達(dá)本胺組細(xì)胞ERCC1較對照組表達(dá)量有明顯減少，聯(lián)合用藥組細(xì)胞ERCC1較空白對照組表達(dá)量亦明顯減少，表明西達(dá)本胺能降低細(xì)胞ERCC1的表達(dá)量，從而降低細(xì)胞對順鉑的耐藥性，達(dá)到協(xié)同作用，見圖5。

圖5 西達(dá)本胺和(或)順鉑作用48 h后細(xì)胞ERCC1的相對表達(dá)量Fig 5 Expression level of ERCCI of MDA-MB-231 cells treated with chidamide and(or)cisplatin for 48 h

3 討 論

組蛋白去乙?；敢种苿谷旧|(zhì)組蛋白乙?；皆龈撸淖?nèi)旧w結(jié)構(gòu)，影響基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡［8］。目前報道的已進入臨床或即將進入臨床試驗的組蛋白去乙?；敢种苿┕灿惺鄠€，西達(dá)本胺是我國自主研發(fā)合成的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑［9］，其活性基團為苯酰胺基，底物主要為HDAC3［10］。目前研究發(fā)現(xiàn)，其可抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞［11］、前列腺癌細(xì)胞［12］、結(jié)腸癌細(xì)胞［13］、B 淋巴瘤細(xì)胞［14］、胃癌細(xì)胞［15］的增殖，但未見西達(dá)本胺作用于三陰乳腺癌的相關(guān)報道。順鉑是一種類烷化劑的金屬鉑類化合物，三陰乳腺癌對鉑類藥物相當(dāng)敏感。本研究首次進行了西達(dá)本胺單藥或(和)順鉑體外治療三陰乳腺癌的研究。

MTT結(jié)果表明，西達(dá)本胺和順鉑單藥對MDAMB-231細(xì)胞的生長均有抑制作用，且抑制率隨著藥物劑量及時間的增加而增加，具有劑量時間效應(yīng)依賴關(guān)系。兩藥聯(lián)合作用后對乳腺癌細(xì)胞相同的抑制作用時所需藥物劑量較其單獨作用時極大降低，這對于臨床用藥時降低藥物劑量、減少毒副作用具有極大的意義。

HDACI可以抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的HDAC活性。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，西達(dá)本胺可抑制HDAC1、2、3和10的活性［16］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HDAC3在MDA-MB-231細(xì)胞中有表達(dá)，且西達(dá)本胺能降低HDAC3在此細(xì)胞株中的表達(dá)。西達(dá)本胺抑制HDAC3后可上調(diào)組蛋白H3的乙酰化水平，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，進一步抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［17］。本實驗發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用西達(dá)本胺后與空白組對照，組蛋白H3的乙?；接兴岣?。因此，在表觀遺傳方面顯示，西達(dá)本胺上調(diào)組蛋白H3的乙酰化水平，影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

順鉑對腫瘤的細(xì)胞毒作用主要是通過形成鉑-DNA加合物。順鉑的主要作用靶點是DNA，順鉑進入腫瘤細(xì)胞后水解為雙氯雙氨鉑，然后與細(xì)胞DNA形成順鉑—DNA加合物，影響細(xì)胞DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致DNA損傷，使增殖的細(xì)胞停滯在G2/M期［18］。ERCC1對鉑類藥物化療及其患者生存期具有顯著相關(guān)性［19］，ERCC1過表達(dá)可使停滯在 G2/M期的損傷DNA迅速修復(fù)，尤其是ERCC1能使順鉑誘導(dǎo)的DNA絡(luò)合物的清除增加，導(dǎo)致其對順鉑耐藥［20］。本實驗結(jié)果顯示，西達(dá)本胺聯(lián)合順鉑較單藥順鉑ERCC1的表達(dá)降低。因此，西達(dá)本胺能降低ERCC1的表達(dá)是兩藥聯(lián)合增效的部分原因。

本實驗的意義在于，首次發(fā)現(xiàn)西達(dá)本胺聯(lián)合順鉑在體外能協(xié)同抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，并初步闡明其分子機制，為該方案的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

［1］HU Z，F(xiàn)AN C，OH D S，et al.The molecular portraits of breast tumors are conserved across microarray platforms［J］.BMC Genomics，2006，(7):96.

［2］BERTUCCI F，F(xiàn)INETTI P，CERVERA N，et al.How basal are triple-negative breast cancers?［J］.Int J Cancer，2008，123(1):236-240.

［3］WILLIAM J，IRVIN Jr，LISA A.What is triple-negative breast cancer?［J］.Eur J Cancer，2008，44(18):2799-2805.

［4］DIALLO-DANEBROCK R，TING E，GLUZ O，et al.Prognostic and predictive impact of protein expression profiling in highrisk breast cancer patients treated with high-dose or conventional dose-dense chemotherapy［J］.Clin Cancer Res，2007，13(2):488-497.

［5］CAREY L A，PEROU C M，LIVASY C A，et al.Race，breast cancer subtypes，and survival in the Carolina breast cancer study［J］.JAMA，2006，295(21):2492-2502.

［6］DIALLO-DANEBROCK R，TING E，GLUZ O，et al.Prognostic and predictive impact of protein expression profiling in highrisk breast cancer patients treated with high-dose or conventional dose-dense chemotherapy［J］.Clin Cancer Res，2007，13(2):488-497.

［7］BAUER K R，BROWN M，CRESS R D，et al.Descriptive analysis of estrogen receptor(ER)-negative，progesterone receptor(PR)-negative，and HER2-negative invasive breast cancer，the so-called triple-negative phenotype:a population-based study from the California Cancer Registry［J］.Cance，2007，109(9):1721-1728.

［8］MINUCCI S，PELICEI P G.Histone deacetylase inhibitors and the promise of epigenetic(and more)treatments for cancer［J］.Nat Rev Cancer，2006，6(1):38-51.

［9］尹子卉，吳仲聞，蘭玉坤，等.新型抗腫瘤組蛋白去乙酰化酶抑制劑西達(dá)本胺的合成［J］.中國新藥雜志，2004，13(6):536-538.

［10］鄭杰.腫瘤的細(xì)胞與分子生物學(xué)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2011:249-251.

［11］陳佳，周武慶，陳浩，等.西達(dá)本胺對惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375的體外抗增殖作用［J］.中華皮膚科雜志，2009，42(4):255-258.

［12］程宏，王璇琳，趙麗晶，等.西達(dá)本胺對人前列腺癌DU145及PC3細(xì)胞凋亡的影響［J］.生物技術(shù)通訊，2012，10(4):176-179.

［13］何向明，李蘇宜，劉琳，等.西達(dá)本胺對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖抑制的體外研究［J］.腫瘤學(xué)雜志，2009，15(4):310-313.

［14］李艷瑩，王艷芳.西達(dá)本胺對人B淋巴細(xì)胞株的作用及其機制研究［J］.中國實驗血液學(xué)雜志，2012，20(4):893-899.

［15］周珊，姜藻，顧曉怡.西達(dá)本胺對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡及Notch1、Sirt1基因表達(dá)的影響研究［J］.東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2012，31(3):273-276.

［16］NING Z Q，LI Z B，NEWMAN M J，et al.Chidamide(CSO55/HBI-8000):a new histone deacetylase inhibitor of yhe benzamide class with antitumor activity and the ability to enhance immune cell-mediated humor cell cytotoxicity［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2012，69(4):901-909.

［17］LIU L，CHEN B，QIN S，et al.Anover histone deacetylase inhibitor chidamide induse apoptosis of hum colou cancer cells［J］.Biochem Biophys Commun，2010，292(2):190-195.

［18］ALTAHA R，IAANG X，YU J J，et al.Excision repair cross complementing—group1:gene expression and platinum resistance［J］.Int J Mol Med，2004，14:959-970.

［19］成紅艷，陳寶安，孫新臣，等，ERCC1、XRCC1單核苷酸多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌鉑類藥物化療預(yù)后關(guān)系的研究［J］.東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2011，30(5):717-721.

［20］EBPG Expert Group on Renal Transplantation.European best practice guidelines for renal transplantation［J］.Nephrol Dial Transplant，2002，17(4):34-39.