汪志鵬，劉亞鵬，張明浩，3，陳平，張光珍，梁宗保，鄧慧華，陸祖宏

(東南大學(xué) 1.學(xué)習(xí)科學(xué)研究中心，2.生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210096;3.魯東大學(xué) 心理學(xué)院，山東煙臺(tái) 264000)

學(xué)步期兒童內(nèi)隱問題行為主要是指兒童的內(nèi)部心理環(huán)境表現(xiàn)，即對(duì)新穎環(huán)境的抑制、焦慮以及抑郁［1］。目前，研究者主要從環(huán)境因素和個(gè)體特征因素著手探討了兒童內(nèi)隱問題行為的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制［2-5］。影響兒童內(nèi)隱問題行為除了環(huán)境因素和個(gè)體特征因素，還有遺傳因素。其中，調(diào)節(jié)單胺氧化酶A功能的基因(MAOA基因)影響腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)水平，進(jìn)而影響人類的心理與行為，例如影響臨床抑郁癥和焦慮癥的形成［6］。Fan等［7］基于 9 項(xiàng)研究 2 045 個(gè)患者案例和2 178個(gè)對(duì)照者進(jìn)行元分析，結(jié)果表明MAOA-uVNTR多態(tài)性與重型抑郁癥顯著相關(guān)。而學(xué)步期兒童年齡較小，生活環(huán)境主要集中在家里，受到后天環(huán)境影響小，更有利于研究MAOA基因與抑郁、焦慮等內(nèi)隱問題行為的關(guān)系。作者選擇受后天環(huán)境影響較少的學(xué)步期兒童為研究對(duì)象，來探索MAOA-uVNTR多態(tài)性與抑郁、焦慮等內(nèi)隱問題行為的關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為大型追蹤研究項(xiàng)目《南京都市寶寶》的一部分，采用電話介紹的方法，隨機(jī)招募了2006年6月至2007年3月嬰兒在南京某婦幼保健院出生的418個(gè)家庭(包括嬰兒及其父母)，嬰兒性別比例與該婦幼保健院出生嬰兒男女比例匹配(男∶女為1.06∶1)。入組標(biāo)準(zhǔn)如下:2006年6月至2007年3月在南京某婦幼保健院出生的嬰兒及其父母親;嬰兒為第一產(chǎn);所有的參與者戶口都在南京11個(gè)主城區(qū);父母年齡大于18歲。在學(xué)步期兒童6個(gè)月和24個(gè)月時(shí)，邀請(qǐng)兒童及其父母來參與本研究。由于搬家、失去聯(lián)系、父母因工作忙拒絕參加或者沒有寄回問卷等原因，被試有一定的流失。兒童24個(gè)月時(shí)，299個(gè)兒童(其中男孩152名，女孩147名)的父親和母親均報(bào)告了完整的兒童問題行為數(shù)據(jù)［8］。

1.2 研究程序

在母親懷孕至7至8個(gè)月的時(shí)候，電話聯(lián)系詢問是否參加本研究項(xiàng)目;在嬰兒4至5月齡時(shí)，再次聯(lián)系父母以確認(rèn)是否愿意參加本研究項(xiàng)目，同意則簽訂知情同意書。所有數(shù)據(jù)由經(jīng)過專門培訓(xùn)的研究人員采集。嬰兒6個(gè)月時(shí)，從嬰兒的口腔兩側(cè)用口腔拭子刮取口腔脫落細(xì)胞，然后把棉簽放入0.9%的生理鹽水溶液中并馬上冷藏，另由母親完成人口統(tǒng)計(jì)學(xué)問卷;當(dāng)幼兒24個(gè)月時(shí)，邀請(qǐng)兒童父親和母親分別獨(dú)立完成問題行為問卷。

1.3 研究工具

1.3.1 問題行為問卷 本研究所使用的嬰兒-學(xué)步期兒童社會(huì)情緒量表(The Infant-Toddler Social and Emotional Assessment，ITSEA)在國(guó)外具有良好的信效度［9］。該問卷包含內(nèi)隱問題行為和外顯問題行為兩個(gè)維度;其中內(nèi)隱問題行為可分為抑郁、焦慮兩個(gè)子維度。經(jīng)修訂后，該量表的中文版具有良好的信效度［4］。本研究部分抽取了ITSEA的內(nèi)隱問題行為分量表，共9個(gè)條目。采用likert式3分量表，從“不符合或者很少”、“有些符合或有時(shí)符合”到“非常符合或經(jīng)常符合”3個(gè)等級(jí)，分別給予0、1、2分。本研究采用該中文版問卷由父母報(bào)告兒童的問題行為。對(duì)于父親所報(bào)告的問卷，其抑郁、焦慮2個(gè)子維度的內(nèi)部一致性系數(shù)分別為0.63和0.66;內(nèi)隱問題行為的內(nèi)部一致性系數(shù)為0.83。對(duì)于母親所報(bào)告的問卷，其抑郁、焦慮2個(gè)子維度的內(nèi)部一致性系數(shù)分別為0.63和0.62;內(nèi)隱問題行為的內(nèi)部一致性系數(shù)為0.81。父母報(bào)告的問題行為之間具有中等程度的一致性，父親和母親報(bào)告的內(nèi)隱問題行為相關(guān)系數(shù)為0.52。綜合父母兩者報(bào)告的數(shù)據(jù)可以避免單獨(dú)使用母親或父親報(bào)告數(shù)據(jù)而造成的單一方法偏差，也有助于獲得更全面、更準(zhǔn)確和可信的數(shù)據(jù)。因此，本研究將父親和母親報(bào)告的問題行為的得分?jǐn)?shù)據(jù)加和平均后作為兒童問題行為的得分［10］。

1.3.2 DNA提取和分析 (1)將富集口腔脫落細(xì)胞的口腔拭子放入裝有800～1 000 μl生理鹽水的1.5 ml的Eppendorf管中;(2)將拭子置于振蕩器上，振蕩1 min左右，小心取出棉簽，再用適量的生理鹽水沖洗;(3)13 000 r·min-1離心1 min，小心將多余的上清液全部取走，沉淀物即為脫落細(xì)胞;(4)在沉淀中加入25～50 μl裂解液［25 mmol·L-1NaOH+0.2 mmol·L-1EDTA(乙二胺四乙酸)］，振蕩10 s;(5)98℃孵育20 min，振蕩后加入等體積 Tris-HCl(40 mmol·L-1，pH 5.0);(6)取上清液;(7)加入無水乙醇，-20℃放置15 min或以上;(8)13 000 r·min-1離心15 min;(9)棄上清，晾干后即得到口腔脫落細(xì)胞DNA;(10)加入適量TE溶解DNA(10 mmol·L-1，pH 8.0 Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA)。MAOA-uVNTR 上游引物為5'-ACAGCCTGACCGTGGAGAAG-3'，下游引物5'-GAACGGACGCTCCATTCGGA-3'。變性溫度為95℃，退火溫度為58℃，延伸溫度為72℃。首先，在95℃預(yù)變性1 min;95℃30 s，58 ℃40 s，72 ℃45 s，共35 個(gè)循環(huán)。最后，在72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。MAOA基因位于X染色體上，男孩中有2種等位基因型，本研究分別記為3和4;女孩有3種基因型，本研究分別記為3/3純合子、3/4雜合子和 4/4 純合子［11］。

2 結(jié) 果

將被試的問題行為問卷與MAOA基因匹配后，共有295個(gè)樣本，其中男孩150個(gè)，女孩145個(gè);MAOA基因3型男孩75個(gè)，4型男孩75個(gè);3/3型女孩33個(gè)，3/4型女孩75個(gè)，4/4型女孩37個(gè)。由于MAOA基因位于X染色體上，只有女性有2個(gè)等位基因，因此將女性樣本進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(χ2=0.393，P=0.822)，結(jié)果顯示，女性被試的等位基因分布符合哈迪-溫伯格定律(Hardy-Weinberg Law)［11］。

對(duì)24個(gè)月時(shí)的學(xué)步期兒童抑郁、焦慮和內(nèi)隱問題行為進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來考察其問題行為是否存在顯著的性別差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，學(xué)步期男孩與女孩的抑郁(t=-0.023，df=293，P=0.981)、焦慮(t=-1.048，df=293，P=0.296)以及內(nèi)隱問題行為(t=-0.518，df=293，P=0.605)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。再對(duì)學(xué)步期兒童進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，考察MAOA-uVNTR多態(tài)性對(duì)其抑郁、焦慮和內(nèi)隱問題行為的影響。結(jié)果如表1所示，MAOA-uVNTR多態(tài)性對(duì)男孩和女孩的抑郁、焦慮、內(nèi)隱問題行為均沒有產(chǎn)生顯著的影響。

表1 各基因型男女孩的問題行為的平均水平(±s)Tab 1 The problem behaviors level of boys and girls with different genotypes(±s)

表1 各基因型男女孩的問題行為的平均水平(±s)Tab 1 The problem behaviors level of boys and girls with different genotypes(±s)

指 標(biāo)男孩基因型3 4 t女孩基因型3/3+3/4 4/4t.15 0.980焦慮 0.33±0.33 0.27±0.28 1.230 0.33±0.30 0.38±0.35 -0.849內(nèi)隱問題行為 0.45±0.27 0.38±0.24 1.1732 0.42±0.26 0.48±0抑郁 0.13±0.15 0.16±0.23 -0.824 0.15±0.20 0.12±0.27 -1.126

3 討 論

在本研究中，不論男女，其抑郁、焦慮、以及內(nèi)隱問題行為總分都與MAOA-uVNTR多態(tài)性沒有顯著的關(guān)系。這個(gè)結(jié)果跟實(shí)驗(yàn)預(yù)期不一致。這里主要有3個(gè)原因。

第一，前人關(guān)于MAOA-uVNTR多態(tài)性跟重度抑郁癥和焦慮癥的研究都是對(duì)臨床病人進(jìn)行的［7］，被試對(duì)象都經(jīng)過專家的臨床診斷，而本研究的內(nèi)隱問題行為的抑郁和焦慮只是一種較輕微的情緒狀態(tài)，還沒有達(dá)到臨床癥狀的程度，導(dǎo)致MAOA-uVNTR多態(tài)性對(duì)這種輕微情緒狀態(tài)的作用不是很明顯。

第二，基因的表達(dá)很可能僅發(fā)生在某個(gè)特殊的時(shí)間點(diǎn)，即MAOA基因的表達(dá)在不同的發(fā)展階段對(duì)抑郁、焦慮等內(nèi)隱問題行為的影響不同。因而，盡管MAOA-uVNTR在青少年和成人階段與抑郁癥和焦慮癥顯著相關(guān)［15］，但是在學(xué)步期階段不同基因型之間卻暫時(shí)沒有出現(xiàn)個(gè)體差異。

第三，本研究只關(guān)注MAOA基因的30 bp重復(fù)片段多態(tài)性對(duì)內(nèi)隱問題行為的影響，但是很有可能MAOA基因的其它多態(tài)性和其它與神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)有關(guān)的候選基因(如DRD4、5-HTTLPR多態(tài)性)，以及這些基因的相互作用也會(huì)影響個(gè)體的內(nèi)隱問題行為。例如，Philibert等［12］發(fā)現(xiàn)，在 MAOA 基因啟始密碼子上游1.5 kb處有一段10 bp的可變數(shù)目重復(fù)序列多態(tài)性也能調(diào)節(jié)MAOA基因的轉(zhuǎn)錄水平，而且該基因也與兒童的受虐經(jīng)歷共同作用影響其反社會(huì)人格。Bakermans等［13］發(fā)現(xiàn)，7個(gè)重復(fù)片段的 DRD4基因能預(yù)測(cè)學(xué)前兒童的外顯問題行為。很可能這些基因的相互影響使得MAOA-uVNTR多態(tài)性在內(nèi)隱問題行為上的單獨(dú)作用并不明顯。關(guān)于這些基因如何共同影響個(gè)體的內(nèi)隱問題行為有待于進(jìn)一步探討。另外，由于MAOA-uVNTR多態(tài)性的分布具有種族差異［14］，將此結(jié)果跟其它種族的人群進(jìn)行對(duì)比時(shí)，需要注意其分布。

最后，盡管MAOA-uVNTR多態(tài)性沒有顯著直接影響學(xué)步期兒童的內(nèi)隱問題行為，但遺傳因素與環(huán)境因素可能共同影響內(nèi)隱問題行為的發(fā)展變化［12］，而且在不同的發(fā)展時(shí)期、對(duì)于不同類型的問題行為，它們的作用大小不等和影響方式不同，相互之間的交互作用也不一樣。成人的個(gè)性和行為在一定程度上受到生活閱歷和社會(huì)因素(如文化期望和信仰等)的影響。這些不同的因素在社會(huì)化和發(fā)展過程中可能在不同程度上影響成年期基因跟社會(huì)行為的關(guān)系。如Bartels等［15］對(duì)數(shù)千個(gè)被試進(jìn)行的追蹤研究發(fā)現(xiàn)，遺傳和共享環(huán)境對(duì)問題行為的穩(wěn)定性有不同程度的影響。根據(jù)在早期表達(dá)過的基因在下一個(gè)時(shí)間點(diǎn)仍然有影響的子集的事實(shí)，遺傳對(duì)外顯問題行為和內(nèi)隱問題行為的影響分別為43%和60%;而一系列共享環(huán)境因素則分別貢獻(xiàn)了47%和34%，非共享環(huán)境因素分別貢獻(xiàn)了10%和6%。因而，沒有哪個(gè)因素能單獨(dú)解釋兒童的問題行為的全部結(jié)果。

4 結(jié) 語

研究發(fā)現(xiàn)，擁有3型MAOA基因的男孩，其抑郁、焦慮以及內(nèi)隱問題行為的水平與4型男孩的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);擁有4/4型MAOA基因的女孩，其抑郁、焦慮以及內(nèi)隱問題行為的水平與3/3+3/4型女孩也沒有顯著差異(P＞0.05)。這表明，MAOA-uVNTR多態(tài)性對(duì)學(xué)步期男孩和女孩的抑郁、焦慮以及內(nèi)隱問題行為均沒有顯著影響。

致謝 感謝教育部科技創(chuàng)新工程重大項(xiàng)目基金(704025)的資助;非常感謝作為本研究對(duì)象的兒童及其父母;還感謝美國(guó)賓西法尼亞大學(xué)陳欣銀教授編制問題行為問卷。

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