南富波，李淼淼，王昊龍，韓俊杰，劉偉，李衛(wèi)華

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，石河子 832003）

病毒誘導(dǎo)基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）在研究植物基因功能方面因其具有簡單、快速、高效的特點，成為近幾年來備受學(xué)者們親睞的新技術(shù)[1-2]。小麥淀粉分支酶（starch branching enzyme，SBE）SBEⅡb基因是淀粉合成過程中的關(guān)鍵酶基因之一[3]。八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）是在光合作用過程中類胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶，類胡蘿卜素在植物中具有光保護作用，該基因沉默會引起沉默區(qū)域失綠，因此在VIGS實驗中常用作指示基因[4-5]。

自1995年Kumagai等[6]首次利用重組煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）在本氏煙（Nicotiana benthamiana）中成功沉默了植物內(nèi)源PDS基因以來，2002年Holzberg等[4]首次利用VIGS技術(shù)以大麥條紋花葉病毒（Barley stripe mosaic virus,BSMV）為載體在大麥上實現(xiàn)了PDS基因沉默。2005年Scofield等[7]率先成功實現(xiàn)BSMV誘導(dǎo)小麥苗內(nèi)源基因沉默。最近Bennypaul等[5]還通過構(gòu)建PDS基因的BSMV重組載體研究VIGS的遺傳性。

BSMV-VIGS技術(shù)在小麥上的應(yīng)用主要是研究植株抗病蟲等過程中基因的功能，如賀洋等[8]研究了TaTST基因和小麥白粉病的關(guān)系。Scofield等[7]研究了由Lr21介導(dǎo)的抗葉銹病過程中相關(guān)基因的功能。Van等[9]研究發(fā)現(xiàn)WRKY53基因的轉(zhuǎn)錄因子和苯丙氨酸脫氨酶基因與小麥抗蚜蟲有關(guān)。在品質(zhì)方面，VIGS技術(shù)研究了與蛋白質(zhì)及淀粉合成有關(guān)的基因功能。Ma等[10]在小麥中利用BSMV-VIGS技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)HMW-GS1Bx14和小麥籽粒中麥谷蛋白聚合體合成有關(guān)。Bennypaul等[5]也利用BSMV-VIGS技術(shù)在小麥漸成的籽粒中展示了基因沉默。通過構(gòu)建攜帶有GBSS基因片段的反義結(jié)構(gòu)（pγ.wWxa）和發(fā)夾結(jié)構(gòu) （pγ.wWxhp）在小麥籽粒中實現(xiàn)了GBSS基因的沉默，發(fā)現(xiàn)反義結(jié)構(gòu)使得直鏈淀粉含量降低了32.2%～40.6%，發(fā)夾結(jié)構(gòu)使得直鏈淀粉含量降低了35.8%～39.1%，結(jié)果表明GBSS基因參與了直鏈淀粉的合成過程。

SBE被認為能影響植物淀粉的精細結(jié)構(gòu)[11-12]。有研究表明SBEⅡb編碼基因的突變（玉米ae突變體）可使玉米胚乳中直鏈淀粉的含量達到50%[13]，說明SBEⅡb基因?qū)τ衩着呷橹辨湹矸酆康挠绊懞艽蟆ishi等[13]研究表明，水稻SBEⅡb缺失突變體中，直鏈淀粉含量明顯增加，但支鏈淀粉中DP（degree of polymerization,聚合度）≤13的短鏈減少，從而進一步證實了SBEⅡb與水稻短分支鏈的合成有關(guān)。Francesco等[14]通過RNAi技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)SBEIIa基因沉默的小麥植株，直鏈淀粉含量有顯著的提高。但是，目前在利用BSMV-VIGS技術(shù)研究與小麥淀粉合成直接相關(guān)的SBEⅡb基因功能方面尚未見報道。

本研究選擇小麥淀粉合成關(guān)鍵酶基因SBEⅡb為目的基因，以PDS基因為指示基因，以BSMV為載體，擬構(gòu)建BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重組載體，為下一步利用VIGS技術(shù)在小麥上研究SBEⅡb基因與小麥淀粉合成的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥品種新春11號種子由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供；大麥條紋花葉病毒的α、β、γ及γ-PDS載體由加拿大農(nóng)業(yè)部列橋研究中心John Lu博士惠贈；Trizol試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶及cDNA第一鏈合成試劑盒購自Thermo公司（北京）；pMD19-T Vector、T4DNA Ligase 購自 TaKaRa 公司（大連）；2×Es Taq MasterMix（含染料）酶購自北京康為世紀生物科技有限公司；引物合成及測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 小麥籽?？俁NA提取及cDNA的合成

小麥新春11號種植于大田，管理方式按大田管理。對開花的植株進行標記，取花后12 d的小麥穗子，液氮研磨，按照本實驗室改良的Trizol法提取總RNA[15]，用核酸分析儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，并用cDNA第一鏈合成試劑盒對其進行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 SBE IIb、PDS基因片段的克隆及拼接

根據(jù)GenBank中公布的小麥SBE IIb（AY740401.1）、PDS（FJ517553.1）基因序列，選取特異序列設(shè)計引物，并設(shè)計互補引物，引入PacⅠ和NotⅠ酶切位點（表 1）。

SBEⅡb、PDS基因片段的PCR擴增體系（10 μL）：2×Es Taq MasterMix 5 μL、cDNA 和上、下游引物（10 mmol/L）各 1 μL、ddH2O 2 μL。

擴增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，56 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 40 s，共 30 個循環(huán)；72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的條帶。

將上述純化后的目的條帶經(jīng)濃度測定后等量混合，進行SBEⅡb、PDS基因片段的PCR拼接擴增。

擴增體系為：SSBE Ⅱb的 PCR 產(chǎn)物 1 μL、PDS的 PCR 產(chǎn)物 1 μL、2×Es Taq MasterMix 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL。

按擴增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，擴增5個循環(huán)后，加入SBE IIb上游和PDS下游引物各1 μL、Taq MasterMix 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL 按擴增程序：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，擴增30個循環(huán)，72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的條帶，連接pMD19-T Vector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10。菌液PCR為陽性的菌落提取質(zhì)粒酶切驗證，陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，命名為pMD19-SBEⅡb:PDS。

表1 SBEⅡb、PDS基因片段擴增引物Tab.1 PCR primers of SBEⅡb and PDS genes partial sequences

1.2.3 SBEⅡb:PDS基因的VIGS重組載體構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶PacⅠ/NotⅠ雙切pMD19-SBEⅡb:PDS，回收純化SBEⅡb:PDS基因片段。同時用PacⅠ/NotⅠ酶切 BSMV:γ-PDS 載體，回收純化大片段BSMV:γ。然后將回收的SBEⅡb:PDS基因片段和BSMV:γ連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，菌液 PCR陽性菌落提取質(zhì)粒酶切驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥籽粒總RNA質(zhì)量分析

提取的小麥總RNA，經(jīng)核酸分析儀檢測顯示濃度在2000 ng/μL以上，OD260/OD230在2.00以上。電泳結(jié)果顯示，28和18 S條帶明亮、清晰，說明提取的RNA質(zhì)量較好（圖1）。

圖1 小麥穗子總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA of wheat endosperm

2.2 SBEⅡb、PDS基因片段的克隆及拼接結(jié)果

PDS、SBEⅡb基因片段（圖2）及拼接的PCR擴增結(jié)果（圖3）顯示，電泳條帶清晰，大小與預(yù)期一致。SBEⅡb:PDS基因片段與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10。菌液PCR陽性菌落提取質(zhì)粒酶切驗證，酶切條帶大小與預(yù)期相符（圖4）。

測序結(jié)果（表2）顯示：

獲得1條通讀的重組基因片段，其中克隆的SBEⅡb和PDS基因片段分別長181、190bp，因在引物的接頭處有1個“A”堿基簡并，其組合片段長為370 bp。

序列分析表明：SBEⅡb基因片段與小麥SBEⅡb（AY740401.1）序列同源性 97%；PDS基因片段與PDS（FJ517553.1）序列同源性為97%。

圖2 PDS和SBEⅡb基因片段的PCR擴增電泳圖Fig.2 PCR amplification products of PDS and SBEⅡb gene by agarose gel electrophoresis

圖3 SBEⅡb、PDS基因片段的PCR拼接結(jié)果Fig.3 PCR amp lification products of SBEⅡb and PDS gene by agarose gel electrophoresis

圖4 pMD19-SBEⅡb:PDS酶切驗證Fig.4 The double digestion of pMD19-SBEⅡb:PDS plasmids

表2 SBEⅡb:PDS基因片段測序及拼接結(jié)果Tab.2 The sequencing result of gene segments

2.3 SBEⅡb:PDS基因的VIGS重組載體構(gòu)建

將構(gòu)建的BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10，菌液PCR陽性菌落提取質(zhì)粒酶切驗證。雙酶切鑒定結(jié)果（圖5）表明，目的條帶大小與預(yù)期相符，說明構(gòu)建BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重組載體成功。

圖5 γ-SBEⅡb:PDS酶切驗證Fig.5 The double digestion of γ-SBEⅡb:PDS plasmids using Pac I/Not I

3 討論

本研究選擇提取花后12 d的小麥穗部RNA，是因為研究[16]表明小麥在花后15d左右淀粉的積累速度最快，也因此，在花后15 d后小麥籽粒的成分變得更復(fù)雜，提取的RNA更容易含有雜質(zhì)。

重疊延伸PCR技術(shù)（SOE-PCR）采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來[17]。該技術(shù)已形成3個各具特色的方法分支：重疊延伸拼接、跳躍PCR和DNA重排制備基因雜合體。實施重疊延伸PCR的3個步驟為：1）制備用于重組的DNA組件；2）組件分子作為巨引物互為模板延伸（無引物的熱反應(yīng)）；3）克隆和定向篩選重組產(chǎn)物[18]。重疊互補引物的設(shè)計是該技術(shù)成功的關(guān)鍵，本研究在2個基因的連接處設(shè)計了可同時結(jié)合2個基因引物，因此得到的初級PCR擴增產(chǎn)物可實現(xiàn)互為引物的互相擴增。此外，整個過程不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理。由于Taq DNA聚合酶具有在延伸的3′端加“A”的特性，會在1/2的重組基因片段中引入定點的A突變，因此在篩選過程中我們篩選到的是未引入“A”突變的重組片段構(gòu)建的載體。為徹底防止引入定點“A”突變情況的發(fā)生，建議在制備用于重組的DNA組件時使用具有3′-5′外切酶活性的高保真酶，避免3′端加“A”，從而獲得平末端產(chǎn)物。在第2次拼接PCR反應(yīng)中使用Taq DNA聚合酶，加“A”以便進行TA克隆。

本研究所構(gòu)建的載體經(jīng)酶切及測序等步驟的驗證，說明成功構(gòu)建了含181 bp SBEⅡb基因片段和190 bp PDS基因片段的雙基因VIGS重組載體。其與Gene bank中登錄的其他品種的SBEⅡb基因和PDS基因片段的同源性均達到97%，這說明所選擇的片段有高度的保守性，且總長度370 bp的長度遠大于VIGS技術(shù)能有效沉默基因的理論最低長度23 bp。

4 結(jié)論

本研究經(jīng)過對構(gòu)建的BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重組載體酶切鑒定，成功構(gòu)建了與小麥淀粉合成直接相關(guān)的淀粉分支酶基因SBEⅡb的VIGS重組載體，下一步將在小麥上通過VIGS技術(shù)實現(xiàn)SBEⅡb、PDS基因沉默，研究基因?qū)π←湹矸酆铣傻挠绊憽?/p>

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