祖旭宇，譚 莉，周 茜，王藝蓁(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001)

在我國(guó)北京、上海和廣州等大城市的統(tǒng)計(jì)顯示乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。乳腺癌可通過(guò)血運(yùn)和淋巴等方式發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，侵害肺、骨和肝等器官，是乳腺癌患者治療失敗和死亡的的主要原因。乳腺癌的轉(zhuǎn)移是一個(gè)較為復(fù)雜、由多基因參與的過(guò)程,目前乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不完全清楚。Pokemon，即POK紅髓生成因子(也稱(chēng)為FBI-1或Zbtb7A)，由Zbtb7基因編碼，是BTB-ZF家族成員之一，作為轉(zhuǎn)錄因子Pokemon參與細(xì)胞分化和機(jī)體發(fā)育等多種重要生命活動(dòng)，有研究顯示Pokemon在肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌和鼻咽癌等多種腫瘤中呈現(xiàn)出高表達(dá)，表明它可能在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2-5]。崔明等[6]利用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中pokemon蛋白細(xì)胞核表達(dá)率明顯高于癌旁正常乳腺組織及乳腺增生組織，乳腺癌組織有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組pokemon蛋白細(xì)胞核表達(dá)率顯著高于無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，表明pokemon基因在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本文通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pokemon慢病毒載體，建立穩(wěn)定表達(dá)pokemon的MCF-7細(xì)胞系，觀察pokemon對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7細(xì)胞購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞由DMEM培養(yǎng)(Hyclone,UT)維持，培養(yǎng)基中均含10%小牛血清( 四季青) 、2 mmol/L glutamine 和100 U青霉素(碧云天)，細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 Pokemon過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建及慢病毒的包裝

Pokemon過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建及Pokemon過(guò)表達(dá)慢病毒在293T細(xì)胞內(nèi)的包裝和病毒滴度的測(cè)定參照祖旭宇等[7]研究進(jìn)行。

1.3 病毒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細(xì)胞系建立

取對(duì)數(shù)期MCF-7細(xì)胞按1×105個(gè)/孔種于6孔板中，每孔加2 mL培養(yǎng)基，鋪板時(shí)細(xì)胞融合度為50%左右，并培養(yǎng)24 h。感染實(shí)驗(yàn)分為兩組，即感染含有GFP慢病毒載體和含有FPG-pokemon融合基因慢病毒載體，每組占三個(gè)孔。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%時(shí)，每孔中加入1×108TU/mL滴度的病毒50 μL(MOI：50)，置于37 ℃，5%CO2中培養(yǎng)。12 h后更換普通培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡下觀察熒光。觀察到綠色熒光后，利用新霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)pokemon慢病毒載體的MCF-7細(xì)胞，建立穩(wěn)定性普通表達(dá)及高表達(dá)pokemon的MCF-7乳腺癌細(xì)胞系。

1.4 Western blot分析

為檢測(cè)病毒感染MCF-7細(xì)胞中Pokemon-GFP融合蛋白的表達(dá)情況，對(duì)經(jīng)篩選獲得的MCF-7乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行免疫印跡分析。 將GFP慢病毒載體和含有FPG-pokemon融合基因慢病毒載體感染MCF-7細(xì)胞于裂解液(10 mol/L HEPES,10 mmol/L KCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0,0.1% NP-40,1 mmol/L DTT,1 mmol/L PMSF和0.5 mmol/L Na3VO4)中置冰上30 min制備細(xì)胞抽提物。30 μg可溶性蛋白于12% SDS-PAGE 膠分離,然后蛋白在260 mA下經(jīng)2 h轉(zhuǎn)移至纖維膜。膜由5%牛奶在室溫下封閉45 min后,孵育GFP 一抗(1∶500)(Abcam)1 h,而后孵育羊抗兔IgG(1∶2 000) (Abcam)1 h?？贵w結(jié)合由化學(xué)熒光系統(tǒng)( Pierce,IL)檢測(cè)。

1.5 Transwell檢測(cè)

首先用700 μL含有15%FBS的DMEM培養(yǎng)基種于Transwell小室下室中，然后將200 μL含3×105個(gè)MCF-7細(xì)胞懸液種于Transwell小室上室，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后。取出小室用棉簽將膜上層細(xì)胞拭去，4%多聚甲醛固定5 min，0.5%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)染色細(xì)胞。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空白病毒組及pokemon表達(dá)慢病毒組的MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中，使用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)48 h至融合度90%以上時(shí)，用200 μL移液器吸頭于細(xì)胞表面畫(huà)直線，PBS洗兩次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，分別于0、8、32 h觀察細(xì)胞遷移狀態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定性表達(dá)Pokemon MCF-7細(xì)胞系建立

將空病毒載體和pokemon表達(dá)病毒載體感染MCF-7細(xì)胞后經(jīng)新霉素篩選獲得耐藥性細(xì)胞克隆。在熒光顯微鏡下觀察穩(wěn)定性細(xì)胞克隆中GFP及融合蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)對(duì)照細(xì)胞系中綠色熒光主要集中在胞質(zhì)，而穩(wěn)定性表達(dá)pokemon -GFP融合蛋白表達(dá)主要分布于胞核，這與pokemon作為轉(zhuǎn)錄因子主要分布于細(xì)胞核一致(圖1)。為進(jìn)一步證實(shí)在穩(wěn)定細(xì)胞系中pokemon-GFP融合蛋白的表達(dá)情況，分別提取兩組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系總蛋白，Western blot顯示空病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)組僅有GFP蛋白表達(dá)，而pokemon表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染組中6號(hào)克隆具有pokemon-GFP融合蛋白表達(dá)，說(shuō)明穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功(圖2)。

圖1 空病毒載體及pokemon表達(dá)慢病毒載體(pokemon)感染MCF-7細(xì)胞(×40)

圖2 MCF-7細(xì)胞克隆中GFP和GFP-pokemon融合蛋白表達(dá)

2.2 pokemon對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響

將3×105個(gè)MCF-7細(xì)胞懸液種于Transwell小室上室，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將膜上細(xì)胞擦掉，膜下層的細(xì)胞數(shù)量反應(yīng)了細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。經(jīng)過(guò)染色后，表達(dá)pokemon-GFP融合蛋白組比對(duì)照組(NC組)到達(dá)膜下面的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05，圖3)。

圖3 pokemon對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲能力影響

2.5 pokemon對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響

通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)pokemon對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響，其結(jié)果顯示，對(duì)照組和pokemon-GFP融合蛋白組細(xì)胞遷移的距離于8 h、32 h后無(wú)明顯變化(圖4)。

圖4 pokemon對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響

3 討 論

乳腺癌轉(zhuǎn)移是一個(gè)受多種因素影響，機(jī)制復(fù)雜的過(guò)程，具體機(jī)制尚不清楚，也是乳腺癌防治研究的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)移相關(guān)基因是一類(lèi)功能上能夠促進(jìn)或阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的基因，是腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的內(nèi)在分子基礎(chǔ)[8]。因此揭示相關(guān)基因在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制是乳腺癌防治研究的重要課題。Maeda T等[9]揭示Pokemon可能是一種原癌基因，在腫瘤的形成過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Pokemon位于多種重要原癌基因的上游，調(diào)控多種原癌基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，它的靶基因包括ARF、ADH5/FDH、BIRC5(survivin)、腫瘤抑制因子Rb、原癌基因C-fos 和C-myc等。這些靶基因都主要與細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和生物合成有關(guān)，說(shuō)明pokemon基因在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移和癌變中的重要作用[10-11]。已有研究顯示和正常乳腺組織相比，乳腺癌細(xì)胞中的pokemon存在過(guò)度表達(dá)，且乳腺癌中pokemon高表達(dá)和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[12-13]。

慢病毒載體是由慢病毒改造而來(lái)的載體系統(tǒng)，其具有高效而穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染率，因此成為近年來(lái)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染較常用的載體[14-15]。由于該病毒載體具有GFP和Puromycin抗性篩選標(biāo)記，F(xiàn)IV/Pokemon重組病毒可進(jìn)一步用于動(dòng)物和細(xì)胞模型的建立。MCF-7細(xì)胞系是一種經(jīng)典的乳腺癌細(xì)胞系，其具有分化的乳腺癌上皮細(xì)胞一些特性，如雌二醇合成以及表達(dá)雌激素和孕激素受體[16]，是一種重要的乳腺癌研究細(xì)胞模型。本文分別用空白載體及pokemon慢病毒載體感染MCF-7細(xì)胞，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)并證實(shí)了穩(wěn)定性MCF-7細(xì)胞克隆中pokemon-GFP融合蛋白的表達(dá)。

本研究通過(guò)成功構(gòu)建pokemon表達(dá)慢病毒載體，建立了穩(wěn)定表達(dá)pokemon-GFP MCF-7細(xì)胞系，并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pokemon可抑制MCF-7細(xì)胞侵襲能力，但對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移能力無(wú)顯著影響。Pokemon在細(xì)胞水平可抑制MCF-7細(xì)胞侵襲能力，這一現(xiàn)象與在乳腺癌組織中觀察到pokemon高表達(dá)和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)不一致。而Maeda T等[9]的研究也發(fā)現(xiàn)，雖然pokemon可誘發(fā)腫瘤的形成，但臨床研究卻證實(shí)pokemon在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中的陽(yáng)性率與患者的生存期呈正相關(guān)。最近Wang GC 等[17]的研究證實(shí)pokemon可通過(guò)Sox9通路抑制前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，這說(shuō)明pokemon對(duì)腫瘤發(fā)生的作用可因不同腫瘤基因背景的差異而發(fā)生改變。Pokemon在細(xì)胞水平的功能和其與臨床預(yù)后的相關(guān)性存在不一致，這也進(jìn)一步提示Pokemon在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用存在復(fù)雜性機(jī)制。本文在研究蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT2)在乳腺癌發(fā)生中的作用時(shí)也觀察到類(lèi)似現(xiàn)象：PRMT2可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，但其在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織[18]。由于細(xì)胞較組織器官環(huán)境相對(duì)單一，基因在細(xì)胞與組織器官中可能會(huì)表現(xiàn)出不同功能，而對(duì)基因在細(xì)胞和組織器官中可能存在功能差異機(jī)制的闡明，將有助于人們深入了解基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的復(fù)雜性作用。

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