周勇強(qiáng) 李昌 聶少平 謝明勇

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定食用油中3-MCPD脂肪酸酯

周勇強(qiáng) 李昌 聶少平 謝明勇

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南昌大學(xué)，南昌 330047）

本研究在德國油脂科學(xué)協(xié)會(huì)（DGF）標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行方法優(yōu)化，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，建立了油脂中3-氯-1，2-丙二醇（3-MCPD）脂肪酸酯的分析方法。根據(jù)結(jié)果可知，該方法線性相關(guān)性良好，檢出限為0.022 5 mg／kg，定量限為0.076 0 mg／kg，線性范圍為0.05～5.0 mg／kg，回收率為95.36%～101.18%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.36%～8.14%。試驗(yàn)中同時(shí)利用該方法對(duì)7種常見油脂中3-MCPD脂肪酸酯進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明：該分析方法定性定量準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，能滿足油脂中3-MCPD脂肪酸酯分析檢測(cè)的要求。

GC-MS 3-MCPD脂肪酸酯 油脂

3-氯-1，2丙二醇（3-MCPD）是甘油中的1號(hào)或3號(hào)位的羥基被氯原子取代而形成的一氯取代物。是一種無色、有愉快性香味的油性液體，分子式為 C3H7ClO2，密度為1.320 4 g／cm3（20℃），熔點(diǎn) -40℃，沸點(diǎn)213℃（分解），易溶于乙醇、水、乙醚、丙酮，不溶于四氯化碳、苯和石油醚。圖1為3-MCPD及其脂肪酸酯。

圖1 3-MCPD與其脂肪酸酯

1978年，在酸水解植物蛋白（HVP）中首次檢測(cè)到 3-MCPD的存在［1，2］。此后陸續(xù)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，游離的3-MCPD廣泛地存在于各種熱加工食品中，谷物類食品如吐司、面包皮、餅干［3-4］，咖啡［5］，烤奶酪［6］以及煙熏食品［7］，嬰幼兒食品也有檢出［8］。另外，3-MCPD大多以脂肪酸酯的形式存在，而非自由態(tài)。這種化合物主要形成于食品的加工過程中［9］，尤其是熱加工過程，如油脂的精煉、氫化、脫臭等加工工藝。目前，3-MCPD脂肪酸酯引起了人們廣泛的關(guān)注，這是因?yàn)?-MCPD脂肪酸酯被攝入后，在體內(nèi)被脂肪酶水解成游離的3-MCPD而具有潛在的毒害性，能降低大鼠的精子活性和精子數(shù)量，抑制雄性激素的分泌，使生殖能力下降甚至不育［10］。本試驗(yàn)在DGF標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行方法優(yōu)化，除去樣品中的大量雜質(zhì)，達(dá)到純化的目的。方法準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性好，對(duì)儀器的污染小，能滿足油脂中3-MCPD脂肪酸酯的定性定量分析。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.4%）：德國SIGMAALDRICH公司；氘代同位素d5-3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.3%）：加拿大 CDN isotopes公司；花生油、菜籽油等7種食用油：南昌某市場(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

QL-861型渦旋儀：其林貝爾儀器制造有限公司；Milli-Q Academic型超純水系統(tǒng)：Millipore公司；KQ2200E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DGG-9140B電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；MD200-1氮?dú)獯祾邇x：杭州奧盛儀器有限公司；AL104電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-16G-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；HP-5色譜柱（0.25 mm×30 m×0.25μm）、安捷倫7890A／7000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酯的裂解

稱取100 mg油脂，溶入0.5 mL叔丁基甲醚-乙酸乙酯混合液（4∶1），準(zhǔn)確加入2μg氘代同位素d5-3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)品，加0.5 mL硫酸-丙醇溶液（0.5 mL濃硫酸與100 mL丙醇配比）。超聲15 min，再加入 0.5 mL NaOCH3-甲醇溶液（0.5 mol／L），1 min后，立即加入3 mL乙酸混合液（1 mL乙酸溶解在30 mL 20%NaCl溶液中），并充分渦旋。之后加入3 mL正己烷，充分渦旋后，靜置3 min，待溶液明顯分層，用膠頭滴管盡可能地移去上層。加入3 mL正己烷重復(fù)萃取1次。

1.3.2 衍生化

向剩余溶液中加入500μL的衍生化試劑（2.5 g苯硼酸溶于19 mL丙酮和1 mL水），渦旋，在80℃下放置20 min。待溶液冷卻至室溫，加入2 mL乙酸乙酯，渦旋，靜置分層，將上層溶液移到10 mL離心管，重復(fù)萃取2次。

1.3.3 純化

收集的溶液在60℃下用氮?dú)饩徛蹈?，加? mL異辛烷溶解離心管中的殘留物，渦旋，離心10 min（8 000 r／min）。取 0.5 mL上層清液轉(zhuǎn)移至 GC瓶中，供GC-MS分析。

1.3.4 檢測(cè)

色譜條件：不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積：1μL，進(jìn)樣速度：20 mL／min，載氣：He，1.2 mL／min恒速流動(dòng)；程序溫度：60℃，以 6℃／min上升至 130℃，保持8 min，再以20℃／min上升至250℃并保持5 min。

質(zhì)譜條件：EI+，SIM模式；EI離子源溫度230℃，EI電離能量70 eV；傳輸線溫度：280℃；溶劑延遲：6 min；內(nèi)標(biāo)：m／z＝201，150；3-MCPD：m／z＝196，147。

1.3.5 計(jì)算方法

式中：Q為峰面積的比值；m3-MCPD為衍生化產(chǎn)物中3-MCPD的含量／μg；a為回歸線的斜率；b為回歸線的截距。

式中：Qsample為樣品峰面積的比值；W3-MCPD為3-MCPD樣品溶液的總質(zhì)量／μg；W3-MCPD酯表示為3-MCPD酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；m為測(cè)試樣品的質(zhì)量／g。

由于油脂中3-MCPD脂肪酸酯有sn1-3-MCPD單酯、sn2-3-MCPD單酯和3-MCPD二酯等3種化合物，且種類較多，目前無法通過內(nèi)標(biāo)法直接檢測(cè)，而是通過酯交換將油脂中存在的各種3-MCPD酯轉(zhuǎn)化為游離態(tài)3-MCPD，測(cè)定3-MCDP的含量，以3-MCPD的含量來表示3-MCPD酯的總量。

2 結(jié)果與討論

2.1 d5-3-MCPD和3-MCPD衍生物的定性分析

樣品中的3-MCPD脂肪酸酯在水解后變成游離的3-MCPD，3-MCPD和同位素內(nèi)標(biāo)在經(jīng)苯硼酸衍生后形成相應(yīng)的衍生物。m／z＝196為3-MCPD衍生物的特征離子，m／z＝201為d5-3-MCPD衍生物特征離子。m／z＝147是3-MCPD衍生物失去—CH2Cl而形成的化合物的特征離子，m／z＝150是d5-3-MCPD衍生物失去—CH2Cl而形成的化合物的特征離子［11］。因此通過 m／z＝147，196，150，201可以對(duì)3-MCPD和d5-3-MCPD進(jìn)行定性。

圖2為樣品的總離子掃描色譜圖，分別對(duì)圖中相鄰的2個(gè)色譜峰進(jìn)行質(zhì)譜分析。根據(jù)圖3的質(zhì)譜分析可知，d5-3-MCPD出峰時(shí)間為18.405 min，3-MCPD為18.580 min。與DGF標(biāo)準(zhǔn)方法不同的是，本試驗(yàn)在樣品衍生化后分別采用了氮?dú)獯蹈?、渦旋、離心、取上層清液等方法盡可能地除去溶液中的雜質(zhì)，以達(dá)到純化目的。結(jié)果如圖2所示，3-MCPD和d5-3-MCPD的分離效果良好，不存在共同離子的干擾問題，且離子峰附近幾乎沒有干擾物。結(jié)果表明，優(yōu)化后的分析方法比DGF方法的分離效果更好，雜質(zhì)明顯減少，對(duì)離子峰的干擾更小。

圖2 d5-3-MCPD和3-MCPD衍生物的總離子掃描色譜圖

圖3 d5-3-MCPD和3-MCPD衍生物質(zhì)譜圖

圖4 為 m／z 147，196，150，201等 4種特征離子的選擇性掃描離子色譜圖，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，d5-3-MCPD的m／z150離子峰的峰面積、峰形明顯優(yōu)于m／z 201，因此采用m／z150作為d5-3-MCPD的定量離子。3-MCPD的m／z 147的離子峰優(yōu)于 m／z 196，故采用 m／z 147定量 3-MCPD。m／z 147，150作為定量離子，具有信噪比高、干擾作用小、靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)。

圖4 m／z147，196，150，201選擇性掃描離子色譜圖對(duì)比

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制 0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg／L的 3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)試驗(yàn)處理后進(jìn)樣檢測(cè)（參見1.3試驗(yàn)方法）。以3-MCPD濃度為橫坐標(biāo)，3-MCPD與d5-MCPD峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。

回歸方程為Y＝0.246 4X+0.055 6，R2＝0.999 2，線性相關(guān)性良好，以3倍信噪比作檢出限，10倍信噪比作定量限。此方法線性范圍為0.05～5.0 mg／kg，檢出限為 0.022 5 mg／kg，定量限為 0.076 0 mg／kg，完全滿足油脂中3-MCPD脂肪酸酯的檢測(cè)要求。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 儀器精密度

利用低中高濃度標(biāo)品連續(xù)進(jìn)樣3次，分析測(cè)定值的 RSD。結(jié)果如表 1所示，RSD為 0.07%～1.91%，儀器性能良好，能滿足本試驗(yàn)要求。

2.4 加標(biāo)回收率

取12份菜籽油樣品，3份作空白對(duì)照組，向剩余樣品中分別加入 0.25、0.50、1.00 mg／kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組做3個(gè)平行樣，經(jīng)方法處理后檢測(cè)其中3-MCPD脂肪酸酯含量，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果見表2，3-MCPD脂肪酸酯的加標(biāo)平均回收率為95.36%～101.18%，測(cè)定結(jié)果的RSD為1.36%～8.14%，方法重現(xiàn)性好，能滿足分析的要求。

表2 加標(biāo)回收率

2.5 樣品檢測(cè)

利用上述分析方法對(duì)常見的7種油脂中的3-MCPD脂肪酸酯進(jìn)行檢測(cè)，每種油脂做5個(gè)平行樣，結(jié)果見表3。

表3 常見油脂中3-MCPD脂肪酸酯含量／mg／kg

檢測(cè)結(jié)果表明：山茶油中3-MCPD脂肪酸酯含量最高，平均值達(dá)到1.947 2 mg／kg，棕櫚油次之，平均值為 1.518 3 mg／kg，二者均超過 1 mg／kg。山茶油作為我國最古老的木本食用植物油之一，具有很高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，但是其中的3-MCPD脂肪酸酯含量同樣很高，對(duì)人體具有一定的危害性，所以在選擇山茶油食用和藥用的同時(shí)應(yīng)該考慮到其可能帶來的健康風(fēng)險(xiǎn)。其他5種食用油中3-MCPD脂肪酸酯的含量均低于0.5 mg／kg，其中奶油中3-MCPD脂肪酸酯的含量最低，平均值0.120 5 mg／kg，范圍為0.115 2～0.125 9 mg／kg，大大地低于其他6種食用油中3-MCPD脂肪酸酯的含量，這可能與奶油的冷加工方式有關(guān)。

3 結(jié)論

3.1 DGF標(biāo)準(zhǔn)方法衍生后采用正己烷萃取，萃取效率較低，本試驗(yàn)改用乙酸乙酯多次萃取，萃取效率明顯提高，檢測(cè)靈敏度高，檢出限可達(dá)0.022 5 mg／kg，定量限為 0.076 0 mg／kg。

3.2 DGF標(biāo)準(zhǔn)方法在正己烷萃取后，直接進(jìn)樣分析，未做任何純化步驟，本方法增加氮?dú)獯蹈?、異辛烷溶解、離心等盡可能地除去溶液中的雜質(zhì)。通過氘代同位素內(nèi)標(biāo)d5-3-MCPD和3-MCPD的定性分析得出，此方法處理的樣品基體雜質(zhì)含量少，d5-3-MCPD和3-MCPD離子峰周圍幾乎沒有干擾物。3.3 本方法對(duì)GC-MS條件也做了相應(yīng)的優(yōu)化，使d5-3-MCPD和3-MCPD的分離效果良好，不存在共同離子的干擾。

3.4 方法學(xué)考察結(jié)果顯示，該分析方法具有定性定量準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，能滿足精確的分析要求。

3.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，常見7種食用油中所檢測(cè)的3-MCPD脂肪酸酯的含量較高。

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Determination of 3-MCPD Fatty Acid Esters in Edile Oils by GC-MS

Zhou Yongqiang Li Chang Nie Shaoping Xie Mingyong
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047）

An improved analysis method for testing 3-chloropropane-1，2-diol（3-MCPD）fatty acid esters in oils based on German Society for Fat Science（DGF）standard method has been presented in this study.According to the results，this method has good linear correlation with the limit of detection（LOD）as 0.022 5 mg／kg，limit of quantification（LOQ）as 0.076 0 mg／kg，linear range as 0.05～5.0 mg／kg；the recovery ranged was 95.36%～101.18%with a relative standard deviation of 1.36%～8.14%.Besides，the 3-MCPD fatty acid esters in seven kinds of commercial oils have been detected in order to clarify this method.The results showed that the features of analysis method are excellent in qualitative and quantitative accuracy，high sensitivity and good reproducibility；so it can meet the requiements of 3-MCPD fatty acid esters in oil.

GC-MS，3-MCPD fatty acid esters，oil

TS227

A

1003-0174（2014）03-0110-05

973計(jì)劃（2012CB 720805）

2013-05-20

周勇強(qiáng)，男，1990年出生，碩士，食品安全

聶少平，男，1978年出生，教授，食品化學(xué)與分析，食品營養(yǎng)與安全