佟苗苗， 初 明， 王添敏， 李 娜， 張 慧， 王月丹， 翟延君*

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連116600;2. 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100191)

水紅花子為蓼科植物紅蓼Polygonum orientale L. 的干燥成熟果實，始載于《中國藥典》1977 年版，具有散血消癥、消積止痛、利水消腫的功效，用于癥瘕痞塊、癭瘤腫痛、食積不消、胃脘脹痛等癥［1］。水紅花子主要含有花旗松素、槲皮素、山柰酚等黃酮類成分，本課題組在實驗研究中發(fā)現(xiàn)，總黃酮有較好的抗腫瘤作用，且黃酮中以花旗松素含有量較高。藥理研究表明，花旗松素有降血壓，保護(hù)缺血、缺氧對腦組織的損傷的功效，以及抗炎、抗病毒、抗輻射、抗突變、抗腫瘤等作用［2-4］。因此本實驗以水紅花子總黃酮、花旗松素提取率的總評歸一值為指標(biāo)［5］，采用Box-Behnken 設(shè)計實驗，優(yōu)選出最佳的提取條件，為水紅花子的開發(fā)利用提供理論參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑 Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀，DAD 檢測器(美國Agilent 公司)。島津UV1750 紫外可見分光光度計(日本島津公司)，電子天平(上海天平儀器廠)?；ㄆ焖伤貙φ掌?純度98%，百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司)。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他皆為分析純。

1.2 材料 水紅花子Polygoni Orientalis Fructus 購于河北安國藥材市場，經(jīng)本校中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為蓼科植物紅蓼Polygonum Orientale L. 干燥成熟果實。

2 方法與結(jié)果

2.1 水紅花子總黃酮的測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取花旗松素對照品適量，加65%乙醇制成質(zhì)量濃度為24 μg/mL 的對照品溶液R1 (供測定總黃酮用)，加甲醇制成質(zhì)量濃度為71 μg/mL的對照品溶液R2 (供HPLC 用)。

2.1.2 供試品溶液的制備 精確稱取水紅花子藥材粉末5.0 g，置250 mL 圓底燒瓶中，加65%乙醇100 mL 加熱回流60 min，過濾，定容于100 mL 量瓶中。

2.1.3 波長的選擇 將供試品溶液和對照品溶液分別進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果兩者在290 nm 附近有一最大吸收峰，故選擇檢測波長為290 nm。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取R1 對照品溶液2.00、3.75、5.00、7.50、10.00 mL 稀釋至10 mL 量瓶中，在290 nm 處測定其吸光值。以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y = 0.036X -0.020，r=0.998 9。表明花旗松素在4.80 ～24.00 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 水紅花子總黃酮的測定［6-7］精密吸取供試品溶液0.5 mL，定容于50 mL 量瓶中，按照“2.1.4”項的操作，在290 nm 處測定吸收值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出供試品中總黃酮的量。

2.2 花旗松素的測定

2.2.1 色譜條件 Agilent 色譜柱 (4.6 mm × 150 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-水(B)溶液梯度洗脫(0 ～5 min，5% ～10% A;5 ～10 min，10% ～18% A;10 ～18 min，18% ～28%A;18 ～24 min，28% ～30% A;24 ～34 min)，柱溫25 ℃，檢測波長290 nm，體積流量1.0 mL/min。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取花旗松素對照品溶液(R2)2、4、6、8、10、12 μL 依次注入色譜儀中，測定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y =4 084.5X +48.1，r =0.999 8。表明花旗松素進(jìn)樣量在0.142 ～0.852 μg 范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 花旗松素含有量的測定 精密吸取供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。按外標(biāo)法以峰面積計算花旗松素含有量。

圖1 花旗松素對照品(A)和水紅花子(B)的HPLC 圖譜

2.3 星點設(shè)計實驗

2.3.1 模型擬合 提取因素為提取溶劑乙酸體積分積、提取時間和液料比，因提取次數(shù)為非連續(xù)變量，不能進(jìn)行回歸處理，提取1 次，分析因素見表1，設(shè)計方案及試驗結(jié)果見表2。

表1 因素與水平

由回歸分析表結(jié)果可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對得率有顯著影響，回歸方程失擬性檢驗P =0.330 3 ＞0.05，差異不顯著;總回歸方程P ＜0.01，達(dá)非常顯著水平，說明該方程與實際情況擬合很好，可利用該模型分析預(yù)測最佳提取工藝條件，見表3。

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸分析結(jié)果

2.4 驗證試驗結(jié)果 由簡化后的二項式模型進(jìn)行預(yù)測分析，最優(yōu)工藝為:采用20 倍量66%的乙醇提取1 次，時間為93 min。按最優(yōu)工藝進(jìn)行驗證，結(jié)果見表4。表4 可知，模型是比較可靠的，證明用效應(yīng)面法來優(yōu)化水紅花子總黃酮和花旗松素工藝是可行的。

表4 預(yù)測值與實際值的比較

3 討論

3.1 已報道的水紅花子總黃酮測定的文獻(xiàn)中，多以蘆丁為對照品［8-9］，但蘆丁不是水紅花子的異性成分，不能很好地反映藥材內(nèi)在質(zhì)量［10］。水紅花子中含有量較高的花旗松素的最大吸收波長為290 nm，供試品溶液的最大吸收波長為286 nm和318 nm，因此選擇最為接近的290 nm 作為測定波長。

3.2 采用紫外分光光度法對水紅花子中總黃酮進(jìn)行測定，方法簡便經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確可靠，可以用于檢測藥材中的總黃酮。采用HPLC 法測定其主要成分花旗松素，該方法具靈敏、穩(wěn)定、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點。

3.3 水紅花子總黃酮和花旗松素都是該藥材的活性成分且含有量相對較高。采用總評“歸一值”法將水紅花子醇提工藝中的兩指標(biāo)綜合起來，并成功建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化與預(yù)測分析。由于響應(yīng)面優(yōu)化法采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，在中心點進(jìn)行重復(fù)性實驗以提高實驗的精確度，預(yù)測值更接近真實值。試驗表明，最佳工藝簡單、穩(wěn)定，可行。

［1］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］ Wang Y H，Wang W Y，Liao J F，et al. Prevention of macrophage adhesion molecule-1 (Mac-1)-dependent neutrophil firm adhesion by taxifolin through impairment of protein kinase-dependent NADPH oxidase activation and antagonism of G proteinmediated calcium influx［J］. Biochem Pharmacol，2004，67(12):2251-2262.

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［9］ 王小華，鄧 斌，張曉軍，等. 微波法提取水紅花子總黃酮的應(yīng)用研究［J］. 農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2009，169(4):11-13.

［10］ 辛春蘭，潘海峰，李守拙，等. 金蓮花露中總黃酮和葒草苷的測定［J］. 中草藥，2005，36(9):1340-1342.