杜 歡 談忠琴 宋樂蓮 韓曉祥 勵建榮

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系1，杭州 310035)(渤海大學(xué)遼寧省食品與安全重點實驗室2，錦州 121013)

正辛酸甲酯是一種具有酒、水果、甜橙香氣的無色至淺黃色澄清液體，常用于食品工業(yè)和化妝品的香料配料，此外，還用于染料、香料、醫(yī)藥的合成，也可用于酸性蛋白質(zhì)的沉淀，在蛋白純化中有較廣泛的應(yīng)用。目前工業(yè)制備辛酸甲酯的方法有很多，最主要的是用正辛酸與甲醇在硫酸催化下進行酯化反應(yīng)，但硫酸催化時存在活性低、選擇性差、易發(fā)生副反應(yīng)、產(chǎn)物不易提純、腐蝕性強、污染環(huán)境嚴(yán)重等缺點，不符合當(dāng)今可持續(xù)發(fā)展的要求[1]。采用固體酸、金屬鹽類、堿性脂肪酶等催化劑[2-10]，雖然在一定程度上解決了傳統(tǒng)催化劑存在的一些缺點，但它們?nèi)源嬖谙鄬钚缘?、表面易積碳、酸性位密度低和酸強度分布不均等缺陷[11]，從而限制了它們的應(yīng)用。

微乳體系是指由油、水、表面活性劑和助劑按照一定比例自發(fā)形成的熱力學(xué)穩(wěn)定的、外觀透明或半透明的高度分散體系，其分散相膠束粒徑為10～100 nm，具有超低的界面張力，穩(wěn)定的熱力學(xué)特性及對難溶液體的強溶解性，且價格廉價，廣泛用于納米材料制備、有機化學(xué)反應(yīng)、聚合反應(yīng)、酶催化、分離等領(lǐng)域[12-16]。微乳體系作為反應(yīng)介質(zhì)時可克服試劑不相溶性，改善反應(yīng)物局部濃度，增強區(qū)域選擇性，提高酶的穩(wěn)定性等，從而提高反應(yīng)速率。脂肪酶作為一種生物催化劑，在合成反應(yīng)中具有很高的區(qū)域選擇性和立體選擇性，在微乳體系中進行脂肪酶催化反應(yīng)已有研究報道[17-20]。

在十二烷基苯磺酸(DBSA)/環(huán)己烷/水微乳體系中分別進行了有無脂肪酶PPL催化下香料正辛酸甲酯的合成研究，同時考察微乳體系中含水量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、緩沖溶液pH值、醇酸物質(zhì)的量比、加酶量等因素對正辛酸甲酯轉(zhuǎn)化率的影響，并采用響應(yīng)面分析法對正辛酸甲酯的合成反應(yīng)條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DBSA：日本Tokyo Kasei Kogyo有限公司；豬胰脂肪酶(PPL)：Sigma-Aldrich公司；環(huán)己烷、正辛酸、甲醇、氫氧化鈉、酚酞及其他試劑：邁瑞化學(xué)試劑公司。

1.2 微乳體系的制備

將一定質(zhì)量的DBSA與環(huán)己烷混合，在磁力攪拌器上邊攪拌邊滴加去離子水，當(dāng)混合溶液變澄清時，所加水量記作第一相變點，繼續(xù)滴加，當(dāng)溶液變渾濁時，所加水量記作第二相變點，中間一段澄清的溶液稱為微乳液。改變DBSA與環(huán)己烷的比例，重復(fù)上述操作，測得一系列相變點數(shù)據(jù)，根據(jù)相變點處DBSA、環(huán)己烷、水3個組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，用Origin 8.0繪制三相圖，確定微乳區(qū)與非微乳區(qū)。

根據(jù)所繪制的三相圖，在微乳區(qū)中任取幾個特殊點，將DBSA、環(huán)己烷和水三組分按其對應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)混合，均勻攪拌后即可配成澄清透明的微乳體系，以作為合成正辛酸甲酯的反應(yīng)體系。酯化反應(yīng)結(jié)束后，用氣相色譜法檢測正辛酸的轉(zhuǎn)化率，根據(jù)轉(zhuǎn)化率的大小，確定微乳區(qū)的最大反應(yīng)點，并將此最大反應(yīng)點作為研究正辛酸酯化反應(yīng)單因素影響的反應(yīng)點。

1.3 微乳體系中正辛酸甲酯的合成

在圓底燒瓶中分別加入形成微乳體系的3個組分，磁力攪拌30 min，形成均勻澄清透明的微乳體系。向微乳體系中加入正辛酸和甲醇，在水浴條件下進行酯化反應(yīng)。酯化反應(yīng)產(chǎn)物在Agilent 689 0N氣相色譜儀上進行定量分析，F(xiàn)ID 檢測器，HP-5毛細(xì)管柱，月桂酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 含水量w0對酯化反應(yīng)的影響

圖1為DBSA/環(huán)己烷/水體系的三組分相圖。由圖1可以看出，微乳區(qū)域較小，多相體系(即非微乳區(qū))較大；在微乳區(qū)內(nèi)，DBSA與環(huán)己烷在少量水存在下即可互溶，形成均勻澄清的反應(yīng)體系。

圖1 DBSA/環(huán)己烷/水體系的三組分相圖

微乳體系中，水的含量用w0表示，它是指水與表面活性劑DBSA的物質(zhì)的量之比。w0對DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中正辛酸甲酯的產(chǎn)率有著重要影響，具體反應(yīng)結(jié)果見圖2。由圖2可見，有無脂肪酶存在條件下，微乳體系水的含量w0和正辛酸甲酯產(chǎn)率的變化關(guān)系均像鐘形輪廓形狀，并在w0=3時有最大轉(zhuǎn)化率。一般來說，微乳體系中，酯化反應(yīng)發(fā)生在相界面處，相界面處的面積越大，底物分子間的接觸越充分，從而增加反應(yīng)速度，提高反應(yīng)產(chǎn)率。隨著w0值(1～3)的增加，界面增加，同時反應(yīng)過程中生成的水參與微乳體系的形成，有利于反應(yīng)平衡進一步向右移動，正辛酸甲酯的收率增加。對于有酶體系來說，低w0時，水主要與表面活性劑結(jié)合，而使酶保持活性構(gòu)象所需的自由水較少，從而抑制酶的活力，隨著w0的增大，自由水增多，酶的活性增大，反應(yīng)速度加快，酯化率增加。當(dāng)w0值增加到一定程度時，過量水的存在可使微乳體系轉(zhuǎn)變?yōu)槿闈嵋夯蛘卟环€(wěn)定體系，相接觸面積減少，反應(yīng)速度降低，對有酶體系來說，過量的水還使得酶分子周圍的水殼太厚, 不利于酶與底物的充分接觸, 從而影響酶活性的充分發(fā)揮。另外過量水將使酯化反應(yīng)平衡向逆反應(yīng)方向進行，促進水解反應(yīng)，降低轉(zhuǎn)化率，因此，試驗中選擇微乳體系中含水量w0=3為宜。

圖2 含水量w0對酯化反應(yīng)的影響

2.2 反應(yīng)溫度對酯化反應(yīng)的影響

正辛酸0.5 mmol，醇酸物質(zhì)的量比10∶1，w0=3，反應(yīng)4.0 h條件下，考察DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中不同反應(yīng)溫度對酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可見，無論在不加酶微乳體系和加酶微乳體系中，隨著反應(yīng)溫度的升高，轉(zhuǎn)化率均呈現(xiàn)增大趨勢，在40 ℃以后轉(zhuǎn)化率趨于平緩下降，與通常動力學(xué)反應(yīng)規(guī)律相同。這是因為在低溫時，溫度的升高有利于DBSA的酸催化作用，當(dāng)T=40 ℃時，反應(yīng)基本達(dá)到平衡，正辛酸甲酯收率達(dá)到最高為87.7%，進一步增加反應(yīng)溫度，即T>40 ℃時，此時雖然DBSA的酸催化作用增強，但是隨著溫度的升高，微乳體系越來越不穩(wěn)定，同時酯水解反應(yīng)活性增強，表現(xiàn)為酯化率并沒有隨溫度的升高而增強，反而呈現(xiàn)下降趨勢。因此，無酶存在時反應(yīng)溫度控制在40 ℃為宜。由圖3亦知，低溫酶存在時，酶催化反應(yīng)活力隨溫度的升高而增強，40 ℃時酶催化反應(yīng)活性達(dá)最大，辛酸甲酯收率最高為92.1%。進一步增加反應(yīng)溫度，即溫度超過40 ℃時，酶催化反應(yīng)酯化率有下降趨勢。由于高溫常使酶難以保持活性構(gòu)象，從而降低酶活力，導(dǎo)致反應(yīng)速率隨溫度身高而降低，而高溫提高了DBSA 的酸催化作用，兩者相互作用的結(jié)果，使得辛酸甲酯的收率并未出現(xiàn)明顯降低。進一步增加反應(yīng)溫度，酶活力進一步降低，此時DBSA催化的酯水解副反應(yīng)活性增加，從而酯化率降低。

圖3 反應(yīng)溫度對酯化反應(yīng)的影響

2.3 反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)的影響

正辛酸0.5 mmol，醇酸物質(zhì)的量比為10∶1，w0=3，反應(yīng)溫度40 ℃條件下，考察DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)的影響

由圖4可見，有無脂肪酶存在時，該微乳體系進行酯化反應(yīng)時均具有較好的催化活性，說明該微乳體系中，DBSA具有雙重作用，除作為表面活性劑與環(huán)己烷、水形成微乳體系外，還可作為Br?nsted酸對酯化反應(yīng)具有一定的催化能力。脂肪酶存在下，反應(yīng)3.0 h時，酯化率即達(dá)到86.5%，無酶存在時酯化率為77.4%。隨著反應(yīng)時間的延長，酯化率逐漸升高，無酶存在時酯化反應(yīng)速率增加更明顯。當(dāng)反應(yīng)時間為4.0 h時，酯化率達(dá)到最大值。延長反應(yīng)時間，酯化率基本保持不變。由于酯化反應(yīng)為可逆反應(yīng)，過長的反應(yīng)時間使得正辛酸甲酯的水解反應(yīng)活性增加，因此反應(yīng)時間以4.0 h為宜。

2.4 醇酸物質(zhì)的量比對酯化反應(yīng)的影響

酯化反應(yīng)是一個可逆反應(yīng)，常通過增加反應(yīng)物的量來提高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，圖5為正辛酸0.5 mmol，w0=3，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)4.0 h條件下，DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中醇酸物質(zhì)的量比對酯化反應(yīng)的影響。由圖5可見，有無脂肪酶存在條件下醇酸物質(zhì)的量比對酯化反應(yīng)的影響均較大。在所考察的范圍內(nèi)，隨著甲醇用量的增加，酯化率逐漸上升，當(dāng)醇酸物質(zhì)的量比超過10∶1時，酯化率分別達(dá)到92.1%和87.7%，且酶存在時，醇酸物質(zhì)的量比對正辛酸甲酯酯化率的影響更明顯。進一步增加甲醇用量，酯化率基本保持不變。這是因為增大甲醇的用量，有利于反應(yīng)向生成酯的方向移動而提高酯化率，但當(dāng)酸醇摩爾比提高到一定程度后，增加醇的量，此時反應(yīng)溶液體積增加較大，催化劑濃度相對變稀，反應(yīng)速度變慢，酯化率有所下降，綜合結(jié)果，辛酸甲酯的收率基本保持不變，因此，醇酸物質(zhì)的量比選為10∶1。

圖5 醇酸物質(zhì)的量比對酯化反應(yīng)的影響

2.5 脂肪酶用量對酯化反應(yīng)的影響

正辛酸0.5 mmol，w0=3，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)4.0 h條件下，考察DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中酶用量對酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可見，加酶量小于6 mg時，酯化率隨著酶用量的增加迅速上升，當(dāng)加酶量等于6 mg時，酯化率最大達(dá)92.1%，進一步增加酶用量，酯化反應(yīng)的產(chǎn)率趨于穩(wěn)定，不再上升。這可能是因為當(dāng)酶的濃度在一定范圍內(nèi)增加時，隨著酶量的增加，酶分子中有越來越多的活性部位與底物接觸[21]，從而使酯化反應(yīng)的產(chǎn)率快速增加，但當(dāng)酶的活性部位增加到一定程度時，可能會由于蛋白質(zhì)的聚集作用而不再與底物接觸，反應(yīng)速率不再增加。因此選擇加酶量為6 mg。

圖6 加酶量對酯化反應(yīng)的影響

2.6 緩沖液pH值對酯化反應(yīng)的影響

酶分子上有許多酸性、堿性氨基酸的側(cè)鏈基團, 這些基團在不同pH氛圍中常具有不同的解離狀態(tài)，或與反應(yīng)底物間存在一定的相互作用，進而影響酶的結(jié)構(gòu)，改變酶催化反應(yīng)活性。試驗中考察了不同緩沖體系對酯化率的影響，見圖7。由圖7可見，體系中酶催化酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率隨pH值呈先增加后減少的趨勢，pH=7.0時，酯化率最高為92.1%，這可能由于PPL酶作為生物催化劑，比較適合中性環(huán)境。酸性和堿性條件下都會使酯化率有不同程度降低，且酸性條件下降低更明顯。這表明酸性對酶活力有較大影響，同時酸性增強增加了酯水解反應(yīng)活性，從而酯化反應(yīng)收率大大降低。

圖7 緩沖溶液pH值對反應(yīng)的影響

2.7 采用響應(yīng)面法優(yōu)化正辛酸甲酯的合成

2.7.1 分析因素的選取及分析方案

根據(jù) Box-Benhnken 的中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，選取含水量、反應(yīng)時間、醇酸物質(zhì)的量比、加酶量這4個因素，采用四因素三水平響應(yīng)面分析方法確定正辛酸甲酯制備最佳工藝條件，試驗因素和水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析法的因素與水平表

以A、B、C和D為自變量，以正辛酸甲酯酯化率為響應(yīng)值(Y)，試驗方案及結(jié)果見表2，29個試驗點可分為兩類：一是析因點，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點，共有24個析因點；二是零點，為區(qū)域中心點，零點試驗重復(fù)5次，用以估計試驗誤差。

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.7.2 模型的建立與顯著性檢驗

以酯化率為響應(yīng)值，通過RSM軟件對其進行方差分析，其結(jié)果見表3。由表3可知，模型F值為57.50，F(xiàn)>F0.01(14,14)=3.70。模型顯著水平遠(yuǎn)小于0.01，表明二次回歸模型高度顯著。實測值與預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)為0.982 9，說明自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，模型的預(yù)測值和實驗值擬合較好?；貧w方差顯著性檢驗結(jié)果表明，該模型回歸顯著，失擬項不顯著。另外，該模型的變異系數(shù)(C.V)為0.78%，在可接受范圍。變異系數(shù)是衡量每個平均值偏離情況的參數(shù)，其值越小，重復(fù)性越好。綜合各參數(shù)，該實驗方法可靠，各因素水平區(qū)間設(shè)計較合理，因此可用該回歸模型預(yù)測正辛酸甲酯的酯化率。

含水量、醇酸物質(zhì)的量比和加酶量一次項均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。含水量、反應(yīng)時間、醇酸物質(zhì)的量比和加酶量二次項也均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。各因素(含水量、反應(yīng)時間、醇酸物質(zhì)的量比和加酶量)對酯化率的影響經(jīng)擬合得到二次多項回歸方程如下：

表3 微乳體系中豬胰脂肪酶催化合成正辛酸

注：*表示該項具有顯著性效應(yīng)；**表示該項具有極顯著效應(yīng)。

Y=+91.91-0.87A+1.18B+2.10C+1.21D-6.14A2-2.33B2-2.41C2-1.87D2-0.28AB-1.23AC-0.040AD-0.065BC-0.87BD-0.16CD

2.7.3 不同因素間的交互影響

借助 Design Expert軟件，依據(jù)回歸方程式來繪制分析圖。RSM的圖形是響應(yīng)值對各試驗因子構(gòu)成的等高線圖和曲面圖，分別見圖8和圖9。響應(yīng)面等高線可以較直觀地反映各因素相互作用對響應(yīng)值的影響。等高線若呈圓形，則交互作用不顯著；若呈橢圓形，則交互作用顯著[22-23]。

從圖8a～圖8c中看出，橫向的等值線較疏，縱向的等值線較密，這說明含水量對酯化率的影響較大，反應(yīng)時間、醇酸物質(zhì)的量比和加酶量這3個因素對正辛酸甲酯收率的影響則相對較小。從圖9a～圖9c中看出，反應(yīng)時間、醇酸物質(zhì)的量比和加酶量分別一定時，正辛酸甲酯產(chǎn)率隨著含水量的增加先增加后逐漸減少。在圖8b和圖8e中，等高線呈斜橢圓形, 說明圖中的兩因素交互作用顯著，與表3方差分析顯著性相符；而其他等高線趨向圓形，兩因素交互作用不明顯，也與方差分析顯著性相符。

圖8 不同因素交互作用影響正辛酸甲酯酯化率的等高線圖

圖9 不同因素交互作用影響正辛酸甲酯酯化率的響應(yīng)面圖

2.7.4 最佳工藝條件

結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析可知，制備正辛酸甲酯最佳工藝參數(shù)為：w0=3，反應(yīng)時間4.01 h，醇酸物質(zhì)的量比11.09，加酶量為6.77 mg，正辛酸甲酯的收率為93.2%?？紤]到實際操作的方便，將最佳反應(yīng)條件修正為：w0=3，反應(yīng)時間為4.0 h，醇酸物質(zhì)的量比為11，加酶量為6.5 mg，在此條件下進行3次平行驗證試驗，測得的平均產(chǎn)率為92.8 %，與理論預(yù)測值基本相符，這說明回歸方程能夠真實地反映各因素對酯化率的影響。

3 結(jié)論

3.1 有無脂肪酶存在時，DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中制備正辛酸甲酯時均具有較好的催化活性，PPL脂肪酶存在更有利于反應(yīng)的進行。微乳體系中DBSA起雙重作用：一是作為表面活性劑，參與穩(wěn)定微乳體系的形成，增大反應(yīng)物之間的接觸，加快反應(yīng)速率；二是作為Br?nsted酸催化酯化反應(yīng)，提高酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。

3.2 DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中PPL脂肪酶催化合成正辛酸甲酯的較佳工藝條件為：w0=3，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)時間4.0 h，醇酸物質(zhì)的量比11，加酶量6.5 mg，緩沖液pH=7。在此條件下，酯化率為92.8%。

[1]張毓瑞, 趙承卜, 韓麗君. 用固體酸H101催化辛酸酯化反應(yīng)[J]. 化學(xué)世界, 1986(7): 299-300

[2]王秋瑩, 楊青山, 許學(xué)翔, 等. 固體超強酸SO42-/TiO2對酯化反應(yīng)的催化作用[J]. 應(yīng)用化學(xué), 1988(4): 76-78

[3]饒蔚蘭, 潘志權(quán), 向守信. 稀土固體超強酸的制備及其對硬脂肪酸酯化反應(yīng)的催化[J]. 應(yīng)用化學(xué), 2011, 28(8): 907-912

[4]張富捐, 張翔宇, 盛淑玲. 硫酸氫鈉催化合成乙酸異戊酯的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2004(1): 116-117

[5]劉春生, 羅根祥. 十二烷基磺酸鐵催化合成乙酸異戊酯[J]. 日用化學(xué)工業(yè)，2004, 34(6): 403-405

[6]卓潤生, 周世新. 用鎢磷雜多酸作催化劑合成己酸乙酯的研究[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用, 1994, 6(4): 103-105

[7]俞善信, 張魯西, 石菲菲. 氯化鐵催化合成羧酸芐酯[J]. 南都學(xué)壇, 2001, 21 (3) : 60-61, 63

[8]Ni J, Meunier F C. Esterification of free fatty acids in sunflower oil over solid acid catalysts using batch and fixed bed-reactors[J]. Applied Catalysis A: General, 2007, 333(1): 122-130

[9]Cramer J F, Dueholm M S, Nielsen S B, et al. Controlling the degree of esterification in lipase catalysed synthesis of xylitol fatty acid esters[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 41(3): 346-352

[10]Nakamura R, Komura K, Sugi Y.The esterification of glycerine with lauric acid catalyzed by multi-valent metal salts. Selective formation of mono-and dilaurins[J]. Catalysis Communications, 2008, 9(4): 511-515

[11]寇元, 楊雅立. 功能化的酸性離子液體[J]. 石油化工, 2004, 33(4): 297-302

[12]Jadhav K R, Shaikh I M, Ambade K W,et al. Applications of microemulsion based drug delivery system[J]. Current Drug Delivery, 2006, 3(3): 267-273

[13]Honore H S. Recent applications of microemulsion electrokinetic chromatography[J]. Electrophoresis, 2003, 24(22-23): 3900-3907

[14]Paul B K, Moulik S P. Uses and applications of microemulsions[J].Current Science, 2001, 80(8): 990-1001

[15]王延平, 孫新波, 趙德智. 微乳液的結(jié)構(gòu)及應(yīng)用進展[J]. 遼寧化工, 2004, 33(2) : 96-98, 116

[16]周國偉, 李干佐, 鄭立強, 等. 不同微乳液體系和微乳液凝膠中的酶催化反應(yīng)[J]. 日用化學(xué)工業(yè), 2001, 31 (3) : 35-39

[17]Xu Y, Zhao C M, Zhang K C. A kinetic study on enzymatic synthesis of ethyl hexanoate by immobilized lipase form Mucor miehei in heptane partially supported by the open project program of the state key laboratory of bioreactor engineering[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 1999, 15(4): 533-536

[18]Wu W H, Akoh C C, Philips R S. Lipase-catalyzed stereo selective esterification of DL-menthol in organic solvents using acid anhydrides as acylating agents[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1996, 18(5): 536-539

[19]周國偉, 黃錫榮, 李越中, 等. 脂肪酶在微乳液和微乳液凝膠中催化辛酸辛醇的酯化反應(yīng)[J]. 生物工程學(xué)報, 2001, 17(2): 224-227

[20]劉俊康, 劉瑛, 殷福珊. 微乳凝膠固定化脂肪酶及其催化酯化反應(yīng)的研究[J]. 日用化學(xué)工業(yè), 2000, 30(5): 9-11

[21]Ghamgui H, Miled N, Reha A, et a1. Production of monoolein by immobilized Staphy lococcus simulans lipase in a solvent-free system: optimization by response surface methodology[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39: 717-723

[22]王允祥, 呂鳳霞, 陸兆新. 杯傘發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)曲面法優(yōu)化研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2004, 27(3):89-94

[23]張豪, 乙引, 洪鯤, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化酶促脂肪酸甲酯化工藝條件[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2011, 27(14): 125-130.