崔麗金 徐國興

白內(nèi)障是中國乃至全世界的首位致盲眼病，氧化損傷在白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。石決明性味咸而微寒，入肝、肺、腎三經(jīng)，為清肝明目、平肝潛陽之藥，可用治目赤翳障、青盲雀目、怕光羞明、視物昏花等各種虛實眼科疾患［1］。石決明自古以來即為清肝明目、退翳除障之藥，已有石決明的復(fù)方制劑用于防治白內(nèi)障的實驗室研究［2，3］。本研究通過體外培養(yǎng)氧化損傷的人晶體上皮細胞探討其抗氧化損傷的作用。

材料與方法

1.材料:(1)實驗細胞:人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cells，HLECsSRA01/04)(上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司)。(2)石決明中藥水提取液:福建醫(yī)科大學(xué)眼科研究院提供。(3)試劑:DMEM/HIGH GLUCOSE(1 ×)、胎牛血清(美國Hyclone 公司);0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(美國Gibco 公司);3%H2O2(南昌白云藥業(yè)有限公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測試盒、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)測試盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測試盒和Bradford 蛋白質(zhì)定量試劑(自南京建成生物工程研究所);CCK-8、PMSF(100mmol/L)、Western 及IP 細胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)。(4)儀器:BIO-RAD 550 型酶標儀(美國)，722G 可見分光光度計，DT5 -3 型臺式低速自動平衡離心機(北京)，臺式高速冷凍離心機(德國)，AIR -TECH BCM - 1000A 型生物潔凈工作臺(蘇州)，THERMO FORMA 311 型水套式CO2培養(yǎng)箱(美國)，OLYMPUS 1 ×70熒光倒置相差顯微鏡(日本)，數(shù)顯恒溫水浴鍋，SHE-Ⅲ型循環(huán)真空泵。

2.方法:(1)實驗分組:人晶體上皮細胞(HLECs)加入含10%胎牛血清的DMEM-HG 培養(yǎng)基中，置于37℃、100%濕度和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至接近瓶底約80%時及時凍存或傳代，按1∶3 ～1∶4 傳代。實驗分組:①空白對照組:HLECs + DMEM 維持液;②陽性對照組:HLECs +DMEM維持液+ 0. 15mmol/L H2O2;③石決明實驗組:HLECs +DMEM 維持液+0.15mmol/L H2O2+不同濃度的石決明提取液(分別為0.001%、0.01%、0.1%、0.3%)。(2)CCK -8 法檢測不同濃度石決明提取物對HLECs 增殖能力的影響:消化并收集生長狀態(tài)良好、呈對數(shù)生長期的HLECs，接種于96 孔培養(yǎng)板中，細胞密度為8 ×104個/毫升，置于37℃、100%濕度和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 天，棄去培養(yǎng)液，按照上述實驗分組，需H2O2干預(yù)的組別用H2O2干預(yù)3h，同時加不同濃度的石決明與細胞共培養(yǎng)1、3 和5 天后除去舊的培養(yǎng)液，各組培養(yǎng)板分別加入10μl CCK-8 和90μl 培養(yǎng)基的混合液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1h 后于全自動酶標儀上450nm 波長比色測定，測定各組的吸光值，即OD 值。細胞活力(%)=(實驗組平均OD 值-空白組平均OD 值)/(正常組平均OD 值-空白組平均OD 值)×100%。(3)檢測石決明提取物對HLECs中SOD、GSH、MDA 水平的影響:消化并收集生長狀態(tài)良好、呈對數(shù)生長期的HLECs，接種于6 孔培養(yǎng)板中，細胞培養(yǎng)及實驗分組同上。按實驗分組加H2O2干預(yù)3h，同時加濃度為0.1%的石決明提取液與細胞共培養(yǎng)5 天后除去舊的培養(yǎng)液，各組各自消化4℃低溫離心，加入300μl 冷的生理鹽水，在冰浴中勻漿3min 左右，按說明書的要求用分光光度計檢測勻漿液中SOD 活力、GSH 和MDA 含量。

3.統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析，用均數(shù)±標準差(±s)表示，單因素方差分析進行樣本均數(shù)間的多重比較，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.不同濃度及時間點石決明提取液對HLECs 增殖能力的影響:據(jù)不同時間點各實驗組HLECs 活力存在變化，且各組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(1 天時，F(xiàn)=23922.421，P ＜0.01;3 天時，F(xiàn)=120605.864，P＜0.01;5 天時，F(xiàn)=150939.452，P ＜0.01)。從而得出圖1，可見H2O2使細胞的活力降低，石決明提取液對H2O2引起的晶狀體上皮細胞氧化損傷具有保護作用，提高其活力，且在一定的時間和濃度范圍內(nèi)具有濃度依賴性。當石決明提取液濃度升高到0.1%，作用時間維持達到3 天時，細胞的活力達到最高。

2.石決明提取液對HLECs 中SOD、GSH、MDA 水平的影響:應(yīng)用化學(xué)比色法檢測空白對照組、陽性對照組和0. 1% 石決明實驗組HLECs 中SOD、GSH、MDA 水平顯示，SOD、GSH 在空白對照組中最高，陽性對照組中的活力最低，3 組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。MDA 在陽性對照組中的含量最高，0.1%石決明實驗組次之，空白對照組最低，3 組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01，表1)。

圖1 不同濃度及時間點石決明提取液對HLECs 活力的影響

表1 石決明提取液對氧化損傷的HLECs 中SOD 活力、GSH 和MDA 含量的影響(±s，n=8)

表1 石決明提取液對氧化損傷的HLECs 中SOD 活力、GSH 和MDA 含量的影響(±s，n=8)

組間SOD 活力、GSH 含量、MDA 含量比較，P ＜0.01

組別SOD 活力(U/mg)GSH 含量(mg/g)MDA 含量(nmol/mg)212.14 ±2.09 25.37 ±0.74 10.89 ±0.40陽性對照組 158.05 ±2.12 15.05 ±0.61 18.11 ±0.27石決明實驗組空白對照組188.64 ±3.02 21.05 ±0.73 14.16 ±0.39

討 論

氧自由基損傷是老年性白內(nèi)障首位危險因素，晶狀體內(nèi)自由基主要是超氧陰離子自由基、羥自由基、H2O2，其中羥自由基損害最嚴重，但超氧陰離子自由基、羥自由基半衰期短，而H2O2相對較穩(wěn)定，且可以從一處轉(zhuǎn)移到另一處，在SOD、過渡金屬(Fe2+、Cu+)存在下發(fā)生歧化。本實驗應(yīng)用H2O2與人晶狀體上皮細胞共培養(yǎng)造成體外培養(yǎng)晶狀體上皮細胞氧化損傷模型［4，5］。各種理化因素均可通過不同途徑導(dǎo)致晶狀體自由基產(chǎn)生，如自由基產(chǎn)生過多或清除障礙，均可導(dǎo)致自由基聚積。自由基最先損害的靶目標是晶狀體上皮細胞，其次是晶狀體纖維。晶狀體上皮細胞是抗氧化損傷的活性中心，通過兩個途徑發(fā)揮抗氧化的作用。第1 個途徑是以還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、抗壞血酸和維生素E 等抗氧化劑為代表的清除自由基機制［6］。GSH 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，分子中半胱氨酸的巰基是該化合物的主要功能基團，巰基具有還原性，作為體內(nèi)重要還原劑保護蛋白質(zhì)或酶分子中的巰基免遭氧化，使蛋白質(zhì)或酶處于活性狀態(tài)。在哺乳動物體內(nèi)，晶狀體是富含GSH 的組織之一?？寡趸赶凳蔷铙w另一個抗氧化屏障，主要是谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和SOD。生理狀態(tài)下晶狀體中氧化和抗氧化二者處于動態(tài)平衡，但當機體氧化物質(zhì)產(chǎn)生過多或清除這些物質(zhì)的能力下降時，晶狀體將受到損傷，表現(xiàn)在GSH、SOD 含量大幅度下降［7］。

實驗中從CCK -8 檢測各實驗分組不同時間點細胞增殖情況的統(tǒng)計數(shù)據(jù)得出的圖1 可見:H2O2使細胞的增殖能力降低，石決明提取液對H2O2引起的晶狀體上皮細胞氧化損傷具有保護作用，提高其增殖能力，恢復(fù)細胞活力，且在一定的時間和濃度范圍內(nèi)具有濃度依賴性。當石決明提取液濃度升高到0.1%，作用時間維持達到3 天時，細胞的增殖能力最高，活力達最佳。

本實驗研究結(jié)果顯示相對于空白對照組，陽性對照組中晶狀體上皮細胞內(nèi)的SOD 活力和GSH 含量降低，提示其抗氧化系統(tǒng)活力減弱，說明H2O2對晶狀體上皮細胞具有氧化損傷作用，石決明組使晶狀體上皮細胞中降低的SOD 活力和GSH 含量有所回升，說明石決明對氧化損傷的晶狀體上皮細胞中抗氧化系統(tǒng)有保護作用，這與石決明對白內(nèi)障大鼠晶體中SOD、GSH 及GSH -PX 的影響結(jié)果相一致［8］。相較于空白對照組，陽性對照組中晶狀體上皮細胞中MDA 明顯增多，提示H2O2使晶體上皮細胞受到氧化損傷，使晶體細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物堆積，石決明組中氧化損傷的晶體細胞內(nèi)MDA 增多有所減輕，降低的SOD 活力和GSH 含量有所回升，說明石決明可能是通過保護晶狀體細胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，促進上皮細胞清除自由基，從而減輕細胞的氧化損傷，使MDA 增多有減少，減輕脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物對細胞膜及蛋白質(zhì)等的攻擊，使晶狀體上皮細胞避免氧化損傷，從而可能具有潛在的抗氧化作用。據(jù)相關(guān)的石決明炮制工藝的研究提示，石決明提取液的主要成分為多種離子，包括Ca、Fe、Zn、Cu、Mn 等［9］。有研究表明Fe、Mn、Zn 等離子在不同時間點對蚯蚓體內(nèi)外的抗氧化酶有不同程度的激活或抑制作用［10］。石決明提取液可能是通過其內(nèi)的離子對酶的活性產(chǎn)生激活，從而進一步在一定程度上保護細胞免受氧化損傷，提高其活力。

1 溫暖榮.石決明散在眼科應(yīng)用舉隅［J］.中西醫(yī)結(jié)合眼科志，1997，15(1):59

2 徐國興，林媛，王婷婷，等.石決明藥理研究及眼科應(yīng)用進展［J］.國際眼科雜志，2009，9(12):2389 -2390

3 劉靜霞，張曉冬，呂瑞民，等. 決明退障丸對亞硒酸鈉性白內(nèi)障大鼠脂質(zhì)過氧化的影響［J］. 中國中醫(yī)藥科技，2005，12(3):143 -145

4 Gajjar D，Patel D，Alapure B，et al. Rapid action of oestradiol against hydrogen peroxide induced oxidative stress in cataractous lens epithelium:an in vitro study［J］. Eye(Lond)，2009，23(6):1456 -1463

5 L?fgren S，F(xiàn)ernando MR，Xing KY，et al.Effect of thioltransferase (glutaredoxin)deletion on cellular sensitivity to oxidative stress and cell proliferation in lens epithelial cells of thioltransferase knockout mouse［J］. Invest Opthalmol Vis Sci，2008，49(10):4497 -4505

6 Reddan JR，Giblin FJ，Kadry R，et al. Protection from oxidative insult in glutathione depleted lens epithelial cells［J］. Exp Eye Res，1999，(68):117 -127

7 張偉，陳翠真.?；撬釋單徕c性白內(nèi)障抑制作用的實驗研究［J］.中華眼科雜志，1998，34:208 -210

8 祁磊，林媛，徐國興，等. 石決明對大鼠白內(nèi)障晶狀體中SOD 和GSH 及GSH-PX 的影響［J］.國際眼科雜志，2011，12(11):2085-2087

9 王文凱，彭小平.石決明炮制研究［J］.中成藥，2004，26(5):377 -379

10 Naqai N，Ito Y，Takeuchi N. Correlation between hyper -sensitivity to hydro- gen peroxide and low defense against Ca2+influx in cataractogenic lens of ihara cataract rats［J］. Biol Pharm Bull，2011，34(7):1005 -1010