馮燕艷 吳衛(wèi)東 普雄明

ERAP1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨基肽酶(endoplasmic reticulum aminopeptidase，ERAP)又名與抗原遞呈相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨肽酶，分布于細(xì)胞表面和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，具有復(fù)雜多樣的生物學(xué)功能，如參與血管形成、蛋白水解、抗原加工和遞呈，調(diào)節(jié)天然免疫反應(yīng)、抗細(xì)菌等。人類基因組中有2 個(gè)高度同源的ERAP 基因，分別編號(hào)為ERAP1 和ERAP2。研究發(fā)現(xiàn)ERAPl 參與許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程［1，2］。目前研究發(fā)現(xiàn)ERAP1 基因與強(qiáng)制性脊柱炎和銀屑病發(fā)病相關(guān)，但對(duì)其作用機(jī)制和調(diào)控機(jī)制尚缺乏深入研究［3，4］。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是目前進(jìn)行核酸定量檢測(cè)較為準(zhǔn)確的方法，可檢測(cè)組織中mRNA 含量，標(biāo)準(zhǔn)品的制備是實(shí)時(shí)熒光PCR 進(jìn)行定量的基礎(chǔ)。考慮到標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性，把目的片段重組至質(zhì)粒中得到穩(wěn)定的重組質(zhì)粒，是制備熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)品的一種策略。本研究采用T-A 克隆法成功構(gòu)建了用于ERAP1 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:手術(shù)切取人類皮膚約30g。通過GenBank 報(bào)道的人ERAP1 基因序列，使用Oligo 6.0 結(jié)合Primier 5.0 引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。目的片段大小為120bp，由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物(P1):5' -ACAGATGGTGTAAAAGGGATGG - 3，下游引物(P2):5' - GCAGTGTCCAAGTGTTCATCAT-3'。pMDl9 -T 載體購(gòu)自寶生物有限公司。pMDl9 -T 載體購(gòu)自寶生物有限公司。大腸桿菌DH5α、瓊脂糖凝膠DNA 片段回收純化試劑盒、質(zhì)粒DNA 純化試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。Real - time PCR 試劑盒、SYBR Green Ⅰ試劑購(gòu)自QIAGEN 公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)使用異氰酸胍、三氯甲烷抽提法提取人皮膚組織總RNA:將約30g 皮膚組織中加入液氮中研磨，盡量磨碎，加入1ml TRNzol，15 ～30℃靜置5min，4℃13000r/min離心10min，吸上清于一新管中，加入200μl 氯仿，上下顛倒劇烈振蕩15s，15 ～30℃靜置2 ～3min，4℃13000r/min 離心15min，將上清液小心轉(zhuǎn)移到Rnase -free 的1.5ml 離心管中，加入等體積的異丙醇，混合均勻。15 ～30℃靜置10min，4℃12000r/min 離心10min。棄去上清，1000μl 70%的乙醇洗滌1次沉淀，4℃7500r/min 離心5min，倒掉液體，靜置干燥，待乙醇揮發(fā)干凈，加30μl ddH2O 水，反復(fù)吹打溶解，-70℃保存。得到的總RNA 使用核酸蛋白分析儀定純度和濃度。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)后，可見28S、18S、5.8S 條帶，RNA 純度在1.80 以上，總RNA 質(zhì)量符合要求。(2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用TAKARA 公司AMV 反轉(zhuǎn)錄酶按40μl 體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用QIAquick PCR Purification Kit 進(jìn)行cDNA 的純化。(3)PCR 擴(kuò)增目的基因:以所提取并純化的cDNA，進(jìn)行普通PCR，擴(kuò)增出標(biāo)準(zhǔn)DNA 片段。配置25μl 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35 次循環(huán)，72℃延伸5min。對(duì)PCR 產(chǎn)物2%瓊脂糖電泳，對(duì)目的片段進(jìn)行切膠回收。(4)重組質(zhì)粒pMD19 -T Vector -GAPDH 的轉(zhuǎn)化、篩選及鑒定:將膠回收產(chǎn)物以1∶3 比例由T4DNA 連接酶連接到pMD19 -T Vector，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含X -GAL 和IPTG 的氨芐青霉素平板中。37℃過夜培養(yǎng)，約14h 后菌落形成，挑選白色菌落，進(jìn)行菌落PCR 檢測(cè)，檢測(cè)陽(yáng)性者，加入有5ml 氨芐LB 培養(yǎng)基的15ml 離心管中，于37℃搖床中震搖培養(yǎng)12 ～16 h，收集菌液送上海生工進(jìn)行測(cè)序，Chromas 軟件分析測(cè)序結(jié)果。(5)質(zhì)粒提取及酶切:測(cè)序正確菌液提取質(zhì)粒，使用Promega 公司的Wizard Plus SV Minipres DNA Purification System 的試劑盒提取質(zhì)粒，以BamHⅠ進(jìn)行過夜酶切使其線性化，酶切產(chǎn)物用DNA 純化回收試劑盒進(jìn)行純化。測(cè)A260 和A280 以分析純度，并計(jì)算原始拷貝濃度。(6)Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:1)梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒溶液的準(zhǔn)備:通過公式計(jì)算回收純化產(chǎn)物(DNA)原液的拷貝數(shù)。計(jì)算公式如下:DNA 拷貝數(shù)(copies/μl)=C ×10-9×6.02 ×1023/M ×660，其中C 為質(zhì)粒DNA 的質(zhì)量濃度(ng/μl)，M 為質(zhì)粒DNA 的堿基對(duì)數(shù)(空載體堿基對(duì)數(shù)+ 插入目的片段堿基對(duì)數(shù))，6.02 ×1023為阿佛加德羅常數(shù)。將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品原液進(jìn)行10 倍倍比稀釋成108～104copies/μl 梯度數(shù)量級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行Real-time PCR 擴(kuò)增。2)熒光定量PCR 測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線:檢測(cè)使用QuantiTect SYBR GEEN 試劑(Qiagen)進(jìn)行real - time PCR(Light Cycler 2.0，Roche)生成ERAP1 基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。Real-time PCR 反應(yīng)體系:SYBR Green 熒光染料10μl，上下游引物各0.5μl，質(zhì)粒DNA 2μl，ddH2O 7μl;反應(yīng)條件:Denaturation 95℃5min;Amplification 95℃30s，55℃30s，72℃30s，45 個(gè)循環(huán);Melting curve 95℃1s，40℃1s。

結(jié) 果

1.總RNA 的提取與檢測(cè):瓊脂糖凝膠電泳檢查提取的總RNA，其條帶清晰，1% 瓊脂糖凝膠電泳100 伏15min 電泳結(jié)果見圖1。

2.DNA 片段普通PCR 產(chǎn)物電泳:以cDNA 為模板進(jìn)行普通PCR，ERAP1 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖見圖2。

圖1 RNA 電泳圖

圖2 ERAP1 基因PCR 產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖

3.酶切質(zhì)粒電泳:提取的質(zhì)粒需要經(jīng)過酶切線形化后，才能進(jìn)行梯度稀釋進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的生成。酶切線形化質(zhì)粒電泳結(jié)果如圖3。

圖3 PUC18 -ERAP1 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

4.重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定:重組質(zhì)粒酶切片段測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank 提供的序列比較，結(jié)果完全重合，表明重組質(zhì)粒PUC18 - ERAP1 構(gòu)建成功。

5.基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖:基因標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，不同梯度質(zhì)粒1、1 ×10-1、1 ×10-2、1 ×10-3、1 ×10-4和1 ×10-5ng/μl real -time PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖由軟件自動(dòng)生成，結(jié)果見圖4。real -time PCR 構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)斜率達(dá)-3.935，靈敏度達(dá)1.0 ×104拷貝/毫升，線性范圍為1.0 ×104～1.00 ×108拷貝/毫升，閾值循環(huán)數(shù)(Ct)與PCR 體系中起始模板量的對(duì)數(shù)值之間有著良好的線性關(guān)系(r2=0.978)，擴(kuò)增效率高(E =89.916%)。經(jīng)過熔解曲線測(cè)定，其Tm 值為78.65℃，主峰位置重疊(圖5)。

圖4 ERAP1 基因擴(kuò)增曲線圖

圖5 ERAP1 基因熔解曲線

討 論

本實(shí)驗(yàn)以從人類皮膚中提取全基因組RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用該cDNA 為模板PCR 擴(kuò)增出120 bp 的片段，通過T - A 連接重組至pMD19 - T 載體中，并轉(zhuǎn)化入DH5α 受體菌，經(jīng)Amp+抗性篩選獲得陽(yáng)性克隆。經(jīng)PCR 擴(kuò)增、雙酶切鑒定和序列分析，證明成功構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒模板進(jìn)行不同濃度梯度稀釋，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果分析，所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較高的擴(kuò)增效率和良好的線性關(guān)系。且PCR 產(chǎn)物為單一的主峰，證明該外標(biāo)準(zhǔn)品為ERAP1 序列上的特異性產(chǎn)物。上述結(jié)果表明，構(gòu)建的重組質(zhì)粒完全可以作為ERAP1 基因熒光定量檢測(cè)的參照標(biāo)準(zhǔn)。

ERAP1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨基肽酶1 基因(endoplasmic reticulum aminopeptidase 1，ERAP1)又名與抗原遞呈相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨肽酶，位于5q15，屬于鋅指金屬基質(zhì)肽酶M1 家族中的“縮宮素酶亞家族”，在人類細(xì)胞均由IFN-γ 和TNF-α 誘導(dǎo)表達(dá)［5，6］。參與許多生化過程:在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中參與內(nèi)源性抗原肽的修飾及遞呈，被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中參與內(nèi)源性抗原肽修飾的關(guān)鍵酶［7］，參與調(diào)節(jié)血壓和血管生成及細(xì)胞因子受體的脫落［8］。而來(lái)自GNF 的數(shù)據(jù)顯示，ERAP1 基因mRNA 在正常皮膚組織和皮膚腫瘤組織均有表達(dá)，但表達(dá)量差別不大。

本實(shí)驗(yàn)所需樣本為皮膚組織，由于目前常規(guī)活檢手術(shù)所取皮膚組織包含部分真皮的纖維組織，研磨相對(duì)困難，故目前提取皮膚組織RNA 方法多為使用試劑盒，雖然提取過程中需要組織較少、實(shí)驗(yàn)要求相對(duì)偏低，但費(fèi)用昂貴，筆者預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所提取RNA含量相對(duì)較低;但本研究只需30g 新鮮皮膚組織，取材后液氮保存，隨后盡量保持液氮中研磨，防止RNA降解，隨后進(jìn)行常規(guī)異氰酸胍、三氯甲烷抽提法提取人皮膚組織總RNA，所提取的基因組RNA 濃度、純度也能達(dá)到反轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)，反轉(zhuǎn)錄后DNA 片段作為PCR 模板，也能獲得預(yù)期效果。熒光染料的優(yōu)勢(shì)在于它能監(jiān)測(cè)任何dsDNA 序列的擴(kuò)增，不需要探針的設(shè)計(jì)，使檢測(cè)方法變得簡(jiǎn)便，同時(shí)也降低了檢測(cè)的成本。本研究過程中已獲得了優(yōu)化的實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)程序，為繼續(xù)開展ERAP1mRNA 檢測(cè)創(chuàng)造了良好的條件，為今后針對(duì)性檢測(cè)不同來(lái)源、不同病種ERAP1 的RNA 含量，并為進(jìn)一步進(jìn)行功能研究打下了一定基礎(chǔ)。

1 Fruci D，Giacomini P，Nicotra MR，et al. Altered expression of endoplasmic reticulum aminopeptidases ERAP1 and ERAP2 in transformed non-lymphoid human tissues［J］. Cell Physiol，2008，216(3):742 -749

2 Liu B，Li DR，Ni P，et al. Expression and significance of differentially expressed protein endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 in ovarian carcinoma with lymph node metastasis［J］. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2010，45(1):41 -44

3 Sun LD，Cheng H，Wang ZX，et al. Association analyses identify six new psoriasis susceptibility loci in the Chinese population［J］. Nat Genet，2010，42(12):1005 -1009

4 Stuart PE，Nair RP，Ellinghaus E，et al. Genome -wide asso - ciation analysis identifies three psoriasis susceptibility loci［J］. Nat Genet，2010，41(12):1000 -1004

5 Tsujimoto M，Hattori A. The oxytocinase subfamily of M1 aminopeptidases［J］. Biochim Biophys Acta，2005，1751:9 -18

6 Forloni M，Albini S，Limongi MZ，et al. NF-kappaB，and not MYCN，regulates MHC class I and endoplasmic reticulum aminopepti -dases in human neuroblastoma cells［J］. Cancer Res，2010，70:916 -924

7 Saveanu L，Carroll O，Lindo V，et al. Concerted peptide trimming by human ERAP1 and ERAP2 aminopeptidase complexes in the endoplasmic reticulum［J］. Nat Immunol，2005，6:689 -697

8 Yamamoto N，Nakayama J，Yamakawa-Kobayashi K. Identification of 33 polymorphisms in the adipocyte - derived leucine aminopeptidase(ALAP)gene and possible association with hypertension［J］. Hum Mutat，2002，19:251 -257