李敬蕊，楊麗文，王春燕，高洪波，吳曉蕾

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北 保定 071001）

γ-氨基丁酸對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗抗氧化酶活性及表達(dá)的影響

李敬蕊，楊麗文，王春燕，高洪波*，吳曉蕾

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北 保定 071001）

采用營(yíng)養(yǎng)液水培方法，研究低氧脅迫下外源GABA對(duì)甜瓜幼苗抗氧化酶（SOD、POD、CAT和APX）活性和同工酶表達(dá)的影響，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)幼苗根系抗氧化酶的基因表達(dá)特性。結(jié)果表明，低氧脅迫處理下，幼苗根系和葉片抗氧化酶活性和同工酶表達(dá)均高于對(duì)照，且根系CmSOD、CmPOD1、CmPOD2、CmCAT、CmAPX基因均上調(diào)表達(dá)；低氧脅迫下外源GABA處理顯著提高幼苗根系和葉片SOD、CAT和APX活性以及同工酶表達(dá)，且根系CmSOD、CmCAT、CmAPX基因相對(duì)表達(dá)量在0.5～1 d迅速提高并達(dá)到最大值，且增加幅度高于低氧脅迫處理。由此可知，GABA通過(guò)促進(jìn)根系抗氧化酶基因快速大量表達(dá)，提高抗氧化酶活性和同工酶的表達(dá)量，從而緩解低氧脅迫對(duì)甜瓜幼苗的傷害。

γ-氨基丁酸；低氧脅迫；甜瓜；抗氧化酶活性；同工酶表達(dá)；基因表達(dá)

甜瓜（Cucumis melo）具有植株生長(zhǎng)速度快、供應(yīng)時(shí)期長(zhǎng)、產(chǎn)量高、效益好等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)設(shè)施栽培的主要蔬菜作物之一。但是，甜瓜根系好氧性強(qiáng)，在土壤栽培條件下，由于土壤緊實(shí)、水分管理不當(dāng)?shù)纫蛩卦斐傻脱趺{迫；在無(wú)土栽培過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)液溶氧濃度低、消耗快、植株根墊的形成等因素也會(huì)造成根際供氧不足[1]。低氧脅迫下甜瓜根系三羧酸循環(huán)和電子傳遞受阻，細(xì)胞質(zhì)pH降低，導(dǎo)致有氧呼吸減弱，無(wú)氧呼吸增強(qiáng)[2]，植物體內(nèi)活性氧含量增加，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)、脂類、核酸等的功能，造成細(xì)胞非程序性死亡，從而導(dǎo)致甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)下降。因此，栽培過(guò)程中土壤的通氣狀況以及營(yíng)養(yǎng)液中的溶氧量已成為限制甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)進(jìn)一步提高的主要因素[3]。

γ-氨基丁酸（GABA）是一種廣泛存在于各種植物和植物體各個(gè)部位的自由態(tài)四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，對(duì)增強(qiáng)植物體抵抗非生物脅迫[4-5]能力發(fā)揮重要作用，且植物抗性的提高與體內(nèi)活性氧代謝關(guān)系極為密切。研究證明，水分脅迫下外源添加GABA可減少煙草葉片的ROS含量[6]；外源GABA可通過(guò)提高玉米幼苗SOD、POD和CAT活性增強(qiáng)幼苗對(duì)鹽脅迫的抗性；加入GABA后，通過(guò)調(diào)節(jié)大麥體內(nèi)活性氧代謝，從而減緩H+和Al3+共同脅迫對(duì)大麥造成的傷害[7]。本文前期研究證明GABA增強(qiáng)植株抗鹽[8]和抗低氧能力[9]均與體內(nèi)活性氧代謝密切相關(guān)。但是，以往對(duì)逆境脅迫下外源GABA功能研究主要集中于活性氧含量和抗氧化酶活性測(cè)定，而對(duì)抗氧化酶活性、相關(guān)同工酶和酶基因表達(dá)同步研究較少。為此，本試驗(yàn)通過(guò)準(zhǔn)確控制營(yíng)養(yǎng)液溶氧量，同步研究外源GABA對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗抗氧化酶活性和同工酶表達(dá)以及抗氧化酶基因表達(dá)的影響，從活性氧代謝角度深入探討GABA提高植物低氧脅迫生理機(jī)制，為通過(guò)外源施用GABA提高植物耐低氧性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2012年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)智能溫室中進(jìn)行。供試甜瓜品種為新疆西域集團(tuán)種業(yè)有限責(zé)任公司提供的耐低氧性較弱的甜瓜“西域一號(hào)（Xiyu No.1）”。

種子經(jīng)過(guò)溫湯浸種消毒、催芽后，播于裝有石英砂的塑料盆中，育苗期溫室晝夜溫度保持27～30℃/16～18℃。待子葉展開(kāi)后視天氣情況和植株生長(zhǎng)情況每1～2 d澆灌1次1/2倍Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。當(dāng)幼苗第2片真葉展平時(shí)，定植于裝有1倍Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的水培槽中培養(yǎng)，用氣泵正常通氣。待幼苗長(zhǎng)至四葉一心時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)整齊一致的健壯幼苗80株，按照每組20株分別定植于裝有18 L Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的塑料盆（0.6 m×0.4 m）中，進(jìn)行如下處理：①對(duì)照（CK）：正常通氣（30 min·h-1），用氣泵維持營(yíng)養(yǎng)液溶氧濃度（DO）為8.0 mg·L-1；②正常通氣+GABA處理（GA）：處理當(dāng)天，在正常通氣的營(yíng)養(yǎng)液中添加5 mmol·L-1GABA（Sigma公司提供）；③低氧脅迫處理（HY）：向營(yíng)養(yǎng)液中通入純凈的N2，用在線溶氧分析儀（Pisco DO500型，德國(guó)）控制營(yíng)養(yǎng)液DO值為（2±0.2）mg·L-1；④低氧脅迫+ GABA處理（HG）：處理當(dāng)天，在低氧脅迫的營(yíng)養(yǎng)液中添加5 mmol·L-1GABA。

前期試驗(yàn)表明HG處理的甜瓜根系根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量等生長(zhǎng)指標(biāo)顯著高于低氧脅迫處理[10]。本試驗(yàn)于處理后4 d選取幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)下第2片完全展開(kāi)的葉片及根系測(cè)定植株抗氧化酶（SOD、POD、CAT和APX）活性，并采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進(jìn)行同工酶分析；于處理后0、0.5、1、2、3、4、6 d選取各處理幼苗根系，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定根系抗氧化酶基因（CmSOD、CmPOD1、CmPOD2、CmCAT、CmAPX）的表達(dá)，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 抗氧化酶活性測(cè)定

超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性分別采用Giannopoliti等[11]、曾韶西等[12]、Dhindsa等[13]和Nakano等[14]方法測(cè)定。

1.2.2 抗氧化酶同工酶酶液制備、電泳及染色

稱取1.0 g各處理甜瓜幼苗的根（葉片），冰浴條件下，加入2 mL酶提取液（pH 8.0磷酸緩沖液，0.1 mol·L-1Tris-HCL），將組織研磨成勻漿狀，13 000 r·min-1，4℃，離心20 min，保留上清液，上清液即為電泳樣品。

采用PAGE進(jìn)行各種同工酶的電泳，POD和CAT同工酶分離膠濃度為7.5%，SOD和APX同工酶分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度均為3%。染色：超氧化物歧化酶（SOD）同工酶采用氮藍(lán)四唑（NBT）法[15]染色、過(guò)氧化物酶（POD）同工酶采用聯(lián)苯胺溶液染色法[16]染色、過(guò)氧化氫酶（CAT）同工酶采用淀粉染色法[16]染色、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）同工酶采用Mittler等方法染色[17]。

1.2.3 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time qPCR）分析

甜瓜根系總RNA采用TaKaRa公司的RNAiso Plus（TotalRNA提取試劑）說(shuō)明書提取，之后反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。根據(jù)qPCR設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)并篩選出特異性最好的引物（見(jiàn)表1）。首先依據(jù)天根試劑盒（SuperReal PreMix SYBR Green）說(shuō)明書要求確定實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系為25 μL：cDNA模版，2 μL；正、反向引物（10 μmol·L-1）各0.75 μL；2×Super?Real PreMix，12.5 μL；最后加9 μL RNase-free ddH2O補(bǔ)充至25 μL。其次，根據(jù)引物的擴(kuò)增條件設(shè)計(jì)qPCR反應(yīng)條件：95℃15 min，預(yù)變性；95℃15 s變性；X℃（各對(duì)引物具體退火溫度如表1所示）20 s，退火；72℃30 s，延伸；40個(gè)循環(huán)。再次，分析各樣品溶解曲線，確定引物的特異性擴(kuò)增。重復(fù)3次，以Actin為內(nèi)參基因。最后，利用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并將結(jié)果（2-△△Ct）轉(zhuǎn)化成線性關(guān)系，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2003和SAS 8.1軟件（SAS Institute,Cary,NC）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、制圖，在5%水平下采用Duncan多重比較法進(jìn)行方差分析。

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Primers design

2 結(jié)果與分析

2.1 外源γ-氨基丁酸(GABA)對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗抗氧化酶活性及同工酶表達(dá)的影響

2.1.1 外源γ-氨基丁酸（GABA）對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗SOD活性及同工酶表達(dá)的影響

圖1A表明，培養(yǎng)4 d后，甜瓜幼苗根系SOD活性由高到低依次為：低氧脅迫+GABA（HG）、低氧脅迫（HY）、正常通氣+GABA（GA）、對(duì)照（CK），其中低氧脅迫+GABA與低氧脅迫處理的甜瓜幼苗根系的SOD活性均顯著高于正常通氣+GABA（GA）和對(duì)照處理。

4個(gè)處理的甜瓜幼苗葉片SOD活性均顯著低于根系，且不同處理間差異較大，其中低氧脅迫下GABA處理的SOD活性最高，其次為低氧處理，對(duì)照的SOD活性最低；4個(gè)處理間SOD活性差異達(dá)顯著水平。

對(duì)處理4 d后的甜瓜幼苗根系與葉片SOD同工酶表達(dá)進(jìn)行電泳檢測(cè)（見(jiàn)圖1B），分離出兩條特異的、較清晰的SOD同工酶譜帶S1和S2，其中S2譜帶表達(dá)明顯強(qiáng)于S1，并且S2在根系中的表達(dá)明顯高于葉片。通過(guò)對(duì)SOD同工酶譜帶進(jìn)一步分析表明：在4個(gè)處理下根系與葉片的SOD同工酶表達(dá)與酶活性相一致，其中低氧脅迫下GABA處理的SOD同工酶表達(dá)明顯強(qiáng)于低氧脅迫處理；在不同處理下根系SOD同工酶的表達(dá)量明顯高于葉片。

圖1 外源γ-氨基丁酸(GABA)對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗SOD活性(A)及同工酶表達(dá)(B、C)的影響Fig.1 Exogenous GABA application induced the changes of SOD activity(A)and isozymes expression(B，C)in melon seedlings under hypoxia stress

2.1.2 外源γ-氨基丁酸（GABA）對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗POD活性及同工酶表達(dá)的影響

從圖2A可知，正常通氣+GABA（GA）處理的幼苗根系POD活性低于對(duì)照（CK），差異達(dá)顯著水平，而葉片POD活性與對(duì)照未達(dá)到顯著差異水平；低氧脅迫（HY）處理的根系和葉片的POD活性顯著高于對(duì)照（CK）；低氧脅迫+GABA（HG）處理的根系和葉片的POD活性均顯著低于低氧處理。不同處理下甜瓜幼苗根系的POD活性均顯著高于葉片。

圖2B表明，在甜瓜根系和葉片中都得到P1、P2、P3和P4四條POD同工酶條帶，且處理間差異較明顯。低氧脅迫處理的甜瓜幼苗根系和葉片的POD同工酶表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照（CK）；低氧脅迫+ GABA（HG）處理的根系和葉片的POD同工酶表達(dá)均明顯弱于低氧處理。而且不同處理的葉片POD同工酶表達(dá)均明顯強(qiáng)于根系。根系與葉片POD同工酶表達(dá)與酶活性相一致。

2.1.3 外源γ-氨基丁酸（GABA）對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗CAT活性及同工酶表達(dá)的影響

圖3A表明，正常通氣+GABA（GA）處理的幼苗根系和葉片CAT活性與對(duì)照（CK）均未達(dá)到顯著差異水平；低氧脅迫（HY）處理的根系和葉片CAT活性顯著高于對(duì)照（CK）；低氧脅迫+GABA（HG）處理的根系和葉片CAT活性進(jìn)一步提高，分別較低氧脅迫（HY）處理提高11.2%、22.2%，均達(dá)顯著水平。不同處理下甜瓜幼苗根系CAT活性均顯著低于葉片。

對(duì)甜瓜幼苗的根系和葉片CAT同工酶表達(dá)進(jìn)行電泳檢測(cè)，如圖3B所示，在葉片和根系中均可以看到1條特異譜帶。根系與葉片CAT同工酶表達(dá)與酶活性一致。低氧脅迫（HY）處理的幼苗根系和葉片CAT同工酶表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照（CK），低氧脅迫+GABA（HG）處理的根系和葉片CAT同工酶表達(dá)明顯強(qiáng)于其他處理。不同處理的根系CAT同工酶表達(dá)量明顯低于葉片。

圖2 外源γ-氨基丁酸(GABA)對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗POD活性(A)及同工酶表達(dá)(B、C)的影響Fig.2 Exogenous GABA application induced the changes of POD activity(A)and isozymes expression(B，C) in melon seedlings under hypoxia stress

圖3 外源γ-氨基丁酸(GABA)對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗CAT活性(A)及同工酶表達(dá)(B、C)的影響Fig.3 Exogenous GABA application induced the changes of CAT activity(A)and isozymes expression(B，C)in melon seedlings under hypoxia stress

2.1.4 外源γ-氨基丁酸（GABA）對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗APX活性及同工酶表達(dá)的影響

由圖4A可知，正常通氣+GABA（GA）處理的幼苗根系和葉片APX活性與對(duì)照（CK）未達(dá)到差異顯著水平；低氧脅迫處理的根系和葉片APX活性均顯著高于對(duì)照（CK）；低氧脅迫+GABA（HG）處理的根系和葉片APX活性顯著高于低氧脅迫（HY）處理，分別較低氧脅迫（HY）處理提高11.1%、23.6%。不同處理的甜瓜幼苗根系A(chǔ)PX活性均顯著高于葉片。

甜瓜幼苗根系和葉片APX同工酶電泳檢測(cè)顯示（見(jiàn)圖4B）：甜瓜幼苗根系和葉片中APX同工酶條帶數(shù)有明顯差異，在根系中有3條特異、較清晰的APX同工酶條帶。葉片中出現(xiàn)兩條新的條帶（A1和A2）。低氧脅迫下添加GABA處理的甜瓜幼苗根系和葉片APX同工酶表達(dá)最強(qiáng)，其次為低氧脅迫處理，兩個(gè)處理明顯強(qiáng)于對(duì)照，對(duì)照APX同工酶表達(dá)最弱。不同處理的根系A(chǔ)PX同工酶表達(dá)均明顯強(qiáng)于葉片。根系與葉片APX同工酶表達(dá)與APX酶活性一致。

圖4 外源γ-氨基丁酸(GABA)對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗APX活性(A)及同工酶表達(dá)(B、C)的影響Fig.4 Exogenous GABA application induced the changes of APX activity(A)and isozymes expression(B，C)in melon seedlings under hypoxia stress

2.2 外源γ-氨基丁酸(GABA)對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗根系抗氧化酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.2.1 外源γ-氨基丁酸（GABA）對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗根系CmSOD基因相對(duì)表達(dá)量的影響

結(jié)果如圖5所示。

圖5 外源γ-氨基丁酸（GABA）對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗根系CmSOD基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Exogenous GABA application induced the changes of relative expression of CmSOD in melon roots under hypoxia stress

圖5表明，在處理的0～6 d中，對(duì)照（CK）處理的甜瓜根系CmSOD基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異；正常通氣+GABA（GA）處理的根系CmSOD基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照未達(dá)到顯著性差異水平；低氧脅迫（HY）處理的根系CmSOD基因相對(duì)表達(dá)量在處理0～4 d顯著高于對(duì)照（CK），并在處理第2天時(shí)達(dá)到最大值，相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照的4.05倍；低氧脅迫下外源GABA處理CmSOD基因相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降趨勢(shì)，在處理第1天時(shí)CmSOD相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，較低氧脅迫處理提前1 d，且上調(diào)表達(dá)量為低氧脅迫（HY）處理的1.73倍。

2.2.2 外源γ-氨基丁酸（GABA）對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗根系CmPOD1基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖6可知，在處理0～6 d中，對(duì)照（CK）處理甜瓜幼苗根系CmPOD1基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著變化；正常通氣條件下外源GABA處理的根系CmPOD1基因相對(duì)表達(dá)量在處理0.5 d和3～4 d顯著低于對(duì)照。低氧脅迫處理的甜瓜幼苗根系CmPOD1基因相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降趨勢(shì)，在整個(gè)處理過(guò)程中均高于其他處理，并在處理2 d時(shí)達(dá)到最大值，為CK的4.12倍；低氧脅迫+GABA（GA）處理的甜瓜幼苗根系CmPOD1基因相對(duì)表達(dá)量在0.5 d達(dá)最大值。

圖6 外源γ-氨基丁酸(GABA)對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗根系CmPOD1基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.6 Exogenous GABA application induced the changes of relative expression of CmPOD1in melon roots under hypoxia stress

2.2.3 外源γ-氨基丁酸（GABA）對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗根系CmPOD2基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖7可知，在處理的整個(gè)過(guò)程中對(duì)照（CK）的甜瓜幼苗根系CmPOD2基因相對(duì)表達(dá)量變化不大；正常通氣+GABA（GA）處理第1天，甜瓜根系CmPOD2基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，之后呈下降趨勢(shì)，并在處理3～6 d低于對(duì)照；低氧脅迫處理的甜瓜幼苗根系CmPOD2基因相對(duì)表達(dá)量在0～4 d均顯著高于對(duì)照，在第1天達(dá)到最大值，為對(duì)照的3.62倍；低氧脅迫加入外源GABA處理甜瓜CmPOD2基因的相對(duì)表達(dá)量也呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在處理第0.5天達(dá)到最高，為低氧脅迫的1.23倍，差異顯著，而在處理1～6 dCmPOD2基因相對(duì)表達(dá)量均顯著低于低氧脅迫處理。

圖7 外源γ-氨基丁酸（GABA）對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗根系CmPOD2基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.7 Exogenous GABA application induced the changes of relative expression ofCmPOD2in melon roots under hypoxia stress

2.2.4 外源γ-氨基丁酸（GABA）對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗根系CmCAT基因相對(duì)表達(dá)量的影響

如圖8所示，在處理的整個(gè)過(guò)程中，對(duì)照（CK）的甜瓜幼苗根系的CmCAT基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著變化；正常通氣條件下添加外源GABA處理的甜瓜幼苗根系CmCAT基因相對(duì)表達(dá)量在處理2～6 d均高于對(duì)照，并達(dá)到顯著水平；低氧脅迫（HY）處理的甜瓜幼苗根系CmCAT基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在處理第3天達(dá)到最大值，為對(duì)照（CK）的2.92倍；低氧脅迫+GABA（HY）處理的甜瓜幼苗根系CmCAT基因相對(duì)表達(dá)量也呈先上升后下降趨勢(shì)，并在處理第1天達(dá)到最大值，較低氧脅迫處理提前2 d。

圖8 外源γ-氨基丁酸(GABA)對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗根系CmCAT基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.8 Exogenous GABA application induced the changes of relative expression ofCmCATin melon roots under hypoxia stress

2.2.5 外源γ-氨基丁酸（GABA）對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗根系CmAPX基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖9可知，在處理的整個(gè)過(guò)程中，對(duì)照（CK）甜瓜幼苗根系CmAPX基因相對(duì)表達(dá)量變化較?。徽Ｍ?GABA（GA）處理CmAPX相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在整個(gè)處理過(guò)程中CmAPX相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照，并在第0.5天時(shí)達(dá)到最大值，為對(duì)照的2.58倍；低氧脅迫（HY）處理的甜瓜幼苗根系CmAPX基因相對(duì)表達(dá)量先呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在處理第3天時(shí)達(dá)到最大值，然后逐漸降低；低氧脅迫下GABA處理CmAPX基因在0.5～1 d時(shí)顯著高于低氧脅迫處理，并在第0.5天時(shí)達(dá)到最大值，為低氧脅迫的3.34倍。

圖9 外源γ-氨基丁酸(GABA)對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗根系CmAPX基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.9 Exogenous GABA application induced the changes of relative expression ofCmAPXin melon roots under hypoxia stress

3 討論與結(jié)論

低氧脅迫使植物葉綠體和線粒體的電子傳遞鏈斷裂，無(wú)法合成ATP，造成細(xì)胞內(nèi)能荷低、還原力增高，植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，使細(xì)胞中產(chǎn)生大量活性氧（ROS）[18]，導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子及膜系統(tǒng)過(guò)氧化反應(yīng)，損傷植物細(xì)胞。為減輕低氧逆境傷害，植物會(huì)通過(guò)體內(nèi)低氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，使細(xì)胞對(duì)氧濃度降低作出快速感應(yīng)，通過(guò)啟動(dòng)或調(diào)節(jié)相關(guān)酶基因表達(dá)、調(diào)節(jié)特異蛋白合成適應(yīng)不利環(huán)境，其中植物細(xì)胞內(nèi)酶促和非酶促活性氧自由基清除系統(tǒng)能有效清除這些有害過(guò)氧化物[19]：SOD可將在低氧脅迫下產(chǎn)生的O2-歧化為H2O2和O2，由此產(chǎn)生的H2O2可在POD和CAT的作用下分解為對(duì)植物生長(zhǎng)無(wú)害的H2O和O2，阻止膜質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)程[20]；在APX作用下植物體內(nèi)抗氧化物質(zhì)AsA也可將H2O2清除[21]。

陸曉民等研究表明，低氧脅迫下，植物根系、葉片SOD、POD等抗氧化酶活性升高，使過(guò)氧化氫等活性氧含量降低，從而緩解低氧脅迫對(duì)黃瓜[22]、八棱海棠[23]等植物的傷害。進(jìn)一步研究證明，活性氧代謝與品種耐低氧性密切相關(guān)，低氧脅迫下，耐性較強(qiáng)的黃瓜品種“綠霸春4號(hào)”抗氧化酶活性高于抗低氧能力較弱的品種“中農(nóng)8號(hào)”[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照處理相比，低氧脅迫下，甜瓜根系CmSOD、CmPOD1、CmPOD2、CmCAT和CmAPX基因均上調(diào)表達(dá)，且在0～4 d表現(xiàn)比較明顯；同時(shí)，低氧脅迫后4 d，甜瓜幼苗根系和葉片抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）活性明顯增加，且抗氧化酶同工酶表達(dá)明顯加強(qiáng)，表現(xiàn)為同工酶圖譜中的一條或多條條帶寬度增加或條帶亮度增加，甜瓜根系抗氧化酶基因表達(dá)與抗氧化酶活性、同工酶表達(dá)一致。表明低氧脅迫誘導(dǎo)甜瓜體內(nèi)抗氧化酶相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)酶促和非酶促活性氧自由基清除系統(tǒng)，誘導(dǎo)抗氧化酶活性和同工酶表達(dá)增強(qiáng)，從而增強(qiáng)幼苗對(duì)低氧的耐性。植物不同部位抗氧化酶活性存在差異，其中根系SOD、POD和APX活性明顯高于葉片，而葉片CAT活性明顯高于根系。

GABA在各種植物及植物的各個(gè)器官中廣泛存在，是細(xì)胞游離氨基酸庫(kù)的重要組成成分，Shelp等研究表明，GABA在植物體內(nèi)信號(hào)傳遞過(guò)程中起“第二信使”的作用，可以通過(guò)參與活性氧代謝、調(diào)節(jié)胞質(zhì)pH等途徑增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的抗性[25]。Ludewig等研究表明，低氧等逆境脅迫下植物體內(nèi)GABA含量可增加幾倍至幾十倍，而GABA支路受阻會(huì)削弱線粒體的呼吸作用，使擬南芥突變體清除H2O2自由基的能力減弱，導(dǎo)致活性氧大量積累[26]。低氧脅迫下，O2缺乏，正常有氧呼吸受到抑制，植物將啟動(dòng)無(wú)氧呼吸代謝，從而導(dǎo)致植物細(xì)胞質(zhì)酸化[27]，谷氨酸脫羧酶的活性被激活，細(xì)胞內(nèi)GABA合成加快，此過(guò)程需要消耗大量H+。因此，可以緩解低氧脅迫對(duì)植物造成的傷害。進(jìn)一步研究證明外源GABA作為一種小分子氨基酸態(tài)氮，可被甜瓜根系直接吸收，而且低氧脅迫下幼苗根系對(duì)GABA吸收速率顯著高于正常通氣下添加GABA處理的甜瓜吸收速率[28]。Ricardo等研究表明，低氧脅迫下，GABA促進(jìn)葡萄VvCAT2基因表達(dá)，而VvAPX、VvGLPX、VvSOD、VvCAT1基因下調(diào)表達(dá)[29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低氧脅迫+GABA（HG）處理的甜瓜根系CmSOD、CmCAT、CmAPX基因相對(duì)表達(dá)量在0.5～1 d時(shí)間段內(nèi)達(dá)到最大值，并顯著高于低氧脅迫處理，而且在時(shí)間上優(yōu)先于低氧脅迫1～2.5 d；幼苗SOD、CAT、APX活性及同工酶表達(dá)均明顯高于低氧處理，與CmSOD、CmCAT、CmAPX基因變化水平一致。表明低氧脅迫下添加外源GABA可通過(guò)促使根系抗氧化酶基因表達(dá)水平上調(diào)，從而使幼苗SOD、CAT、APX活性和同工酶表達(dá)增強(qiáng)。而低氧脅迫下加入外源GABA處理甜瓜根系CmPOD1、CmPOD2基因相對(duì)表達(dá)量低于低氧脅迫處理的甜瓜根系，POD活性、同工酶表達(dá)與甜瓜根系CmPOD1和CmPOD2基因表達(dá)一致，均明顯低于低氧脅迫處理，推測(cè)可能是由于CAT、APX與POD均以H2O2作為底物，三者存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，但是CAT、APX與H2O2的結(jié)合效率高于POD[20]，底物濃度降低可能導(dǎo)致POD活性降低。

綜上所述，甜瓜幼苗根系CmSOD、CmPOD1、CmPOD2、CmCAT、CmAPX基因表達(dá)變化與SOD、POD、CAT、APX活性和同工酶表達(dá)變化一致。低氧脅迫下，甜瓜幼苗根系CmSOD、CmPOD1、CmPOD2、CmCAT、CmAPX基因表達(dá)水平上調(diào)，根系和葉片的SOD、POD、CAT和APX活性、同工酶表達(dá)增強(qiáng)；低氧脅迫下，外源添加GABA可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控甜瓜抗氧化酶基因表達(dá)，根系CmSOD、CmCAT、CmAPX基因表達(dá)顯著高于低氧脅迫處理，而且其相對(duì)表達(dá)量在0.5～1 d時(shí)達(dá)到最高，在時(shí)間上優(yōu)先于低氧脅迫1～2.5 d，有效減緩低氧脅迫對(duì)甜瓜幼苗的傷害。

[1]Biais B,Beauvoit B,Allwood J W,et al.Metabolic acclimation to hypoxia revealed by metabolite gradients in melon fruit[J].Plant Physiology,2010,167(3):242-245.

[2]孫艷軍,郭世榮,胡曉輝,等.根際低氧逆境對(duì)網(wǎng)紋甜瓜幼苗生長(zhǎng)及根系呼吸代謝途徑的影響[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào),2006,30(1): 112-117.

[3]郭世榮,橘昌司,李謙盛.營(yíng)養(yǎng)液溫度和溶解氧濃度對(duì)黃瓜植株氮化合物含量的影響[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào), 2003,29(6):593-596.

[4]Yang R,Guo Q,Gu Z.GABA shunt and polyamine degradation pathway onγ-aminobutyric acid accumulation in germinating fa?va bean(Vicia fabaL.)under hypoxia[J].Food Chemistry,2013, 136(1):152-159.

[5]Kim D W,Shibato J,Agrawal G K,et al.Gene transcription in the leaves of rice undergoing salt-induced morphological changes (Oryza sativaL.)[J].Molecules Cells,2007,24(1):45-59.

[6]Liu C,Zhao L,Yu G.The dominant glutamic acid metabolic flux to produceγ-amino butyric acid over proline inNicotiana tabacumleaves under water stress relates to its significant role in antioxi?dant activity[J].Integrative Plant Biology,2011,53(8):608-618.

[7]Song H,Xu X,Wang H,et al.Exogenous gamma-aminobutyric acid alleviates oxidative damage caused by aluminium and proton stresses on barley seedlings[J].Science of Food and Agriculture, 2010,90(9):1410-1416.

[8]羅黃穎,高洪波,夏慶平,等.γ-氨基丁酸對(duì)鹽脅迫下番茄活性氧代謝及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44 (4):753-761.

[9]高洪波,郭世榮.外源γ-氨基丁酸對(duì)營(yíng)養(yǎng)液低氧脅迫下網(wǎng)紋甜瓜幼苗抗氧化酶活性和活性氧含量的影響[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào),2004,30(6):651-659.

[10]宋鎖玲,李敬蕊,高洪波,等.γ-氨基丁酸對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗氮代謝及礦質(zhì)元素含量的影響[J].園藝學(xué)報(bào),2012,39(4): 695-704.

[11]Giannopolitis C N,Ries S K.Purification and quantitative rela?tionship with water-soluble protein in seedling[J].Plant Physiolo?gy,1977,59:315-318.

[12]曾韶西,王以柔,劉鴻先.低溫光照下與黃瓜子葉葉綠素降低有關(guān)的酶促反應(yīng)[J].植物生理學(xué)報(bào),1991,17(2):177-182.

[13]Dhindsa R S,Plumb-dhindsa P,Thorpe T A.Leaf senescence cor?related with increase levels of membrane permeability and lipid peroxidation and decrease levels dismutase and catalase[J].Exper?imental Botany,1982,32:91-101.

[14]Nakano Y,Asada K.Hydrogen peroxide is scavenged by ascor?bate specific peroxidase in spinach chloroplasts[J].Plant Cell Physiology,1981,22:867-880.

[15]胡能書,萬(wàn)賢同.同工酶技術(shù)及其應(yīng)用[M].長(zhǎng)沙:湖南科技出版社,1985.

[16]鄒琦.植物生理學(xué)指導(dǎo)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2000.

[17]Mittler R,Zilinskas B A.Detection of APX activity in native gels by inhibition of the ascorbate dependent reduction of NBT[J].An?alytical Biochemistry,1993,212(2):540-546.

[18]Blokhima O B,Virolainen E,Fagetstedt K V,et al.Antioxidant status of anoxia-tolerant and intolerant plant species under anox?ia and reaetation[J].Physiologia Plantanm,2000,109:396-403.

[19]Blokhina O,Virolainen E,Fagerstedt K V.Antioxidants,oxidative damage and oxygen deprivation stress:A review[J].Annals of Bot?any,2003,91(1):179-194.

[20]Biemelt S,Keetman U,Albrecht G.Re-aeration following hypox?ia or anoxia leads to activation of the antioxidative defense system in roots of wheat seedlings[J].Plant Physiology,1998,116(2):651-658.

[21]Asada K.Ascorbate peroxidase-a hydrogen peroxide-scavenging enzymeinplants[J].PhysiologiaPlantarum,1992,85(7):235-241.

[22]陸曉民,孫錦,郭世榮,等.油菜素內(nèi)酯對(duì)低氧脅迫黃瓜幼苗根系線粒體抗氧化系統(tǒng)及其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J].園藝學(xué)報(bào), 2012,39(5):888-896.

[23]白團(tuán)輝,馬鋒旺,李翠英,等.水楊酸對(duì)根際低氧脅迫八棱海棠幼苗活性氧代謝的影響[J].園藝學(xué)報(bào),2008,35(2):163-168.

[24]李璟,胡曉輝,郭世榮,等.外源亞精胺對(duì)根際低氧脅迫下黃瓜幼苗根系多胺含量和抗氧化酶活性的影響[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào), 2006,30(1):118-123.

[25]Shelp B J,Mullen R T,Waller J C.Compartmentation of GABA metabolism raises intriguing quertions[J].Trends in Plant Sci?ence,2012,17(2):57-59.

[26]Ludewig F,Hüser A,Fromm H,et al.Mutants of GABA transami?nase(POP2)suppress the severe phenotype ofsuccinic semialde?hyde dehydrogenase(ssadh)mutants inArabidopsis[J].PloS ONE, 2008,3(10):3383-3394.

[27]Crawford L A,Bown A W,Breitkreuz K E,et al.The synthesis ofγ-aminobutyric acid in response to treatments reducing cytosolic pH[J].Plant Physiology,1994,104:865-871.

[28]夏慶平,高洪波,李敬蕊.γ-氨基丁酸(GABA)對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗光合作用和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2011,22(4):999-1006.

[29]Ricardo V,Francisca P,Sebastián R,et al.Hypoxia induces H2O2production and activates antioxidant defence system in grapevine buds through mediation of H2O2and ethylene[J].Experimental Botany,2012,63(11):4123-4131.

Effectofγ-aminobutyricacidonactivitiesandexpressionof antioxdative enzyme in melon seedlings under hypoxia stress

/LI Jingrui, YANG Liwen,WANG Chunyan,GAO Hongbo,WU Xiaolei
(School of Horticulture,Agricultural University of Hebei,Baoding Hebei 071001,China)

This paper investigated the effects of exogenous γ-aminobutyric acid on antioxdative enzyme(SOD,POD,CAT and APX)activities and isozyme expression of melon seedlings under hypoxia stress with hydroponics culture.Meanwhile the characteristics of antioxdative enzyme gene expression of melon seedlings roots were detected by the real-time fluorescent quantitative(RT-PCR).The results showed that the antioxdative enzyme activities and isozyme expression in melon seedlings roots and leaves were higher under hypoxia stress than those under normoxic treatment(control)as well as the gene expression ofCmSOD,CmPOD1,CmPOD2,CmCAT,CmAPXin melon roots were up-regulated.Exogenous GABA application under hypoxia stress could significantly increased the activities and isozyme expression of SOD,CAT and APX in seedlings roots and leaves.Futhermore,the gene expression levels ofCmSOD,CmCAT,CmAPXin roots rapid increased and reached the maximum value after 0.5-1 d with GABA application under hypoxia stress,that increasing extent higher than hypoxia stress treatment.The results suggested that exogenous GABA alleviated the harm of hypoxia tolerance in melon seedlings by promoting rapidly and largely antioxdative enzyme gene expression as well as increasing antioxdative enzyme activities and isozyme expression in melon seedlings.

γ-aminobutyric acid;hypoxia stress;melon;antioxdative enzyme activity;isozyme expression;gene expression

S642.2

A

1005-9369（2014）11-0028-09

2014-06-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30900994）

李敬蕊（1979-），女，講師，碩士研究生，研究方向?yàn)樵O(shè)施園藝植物栽培與育種。E-mail:yyljr@hebau.edu.cn *通訊作者：高洪波，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樵O(shè)施園藝與無(wú)土栽培。E-mail:gaohb@hebau.edu.cn

時(shí)間2014-11-21 16:39:22[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20141121.1639.007.html

李敬蕊,楊麗文,王春燕,等.γ-氨基丁酸對(duì)低氧脅迫下甜瓜幼苗抗氧化酶活性及表達(dá)的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45 (11):28-36.

Li Jingrui,Yang Liwen,Wang Chunyan,et al.Effect ofγ-aminobutyric acid on activities and expression of antioxdative enzyme in melon seedlings under hypoxia stress[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(11):28-36.(in Chinese with English abstract)