范瑞琦 王 晟 揭克敏 熊小亮 肖影群 賀曉菊 劉卓琦 羅達(dá)亞＊

（1南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，南昌330006；2杭州電子科技大學(xué)研究生院，浙江310018；3南昌大學(xué)附屬感染醫(yī)院病理科，江西330002；4江西省婦幼保健院，江西330005）

microRNA（miRNA，miR）是一類(lèi)內(nèi)源性非蛋白編碼的小RNA分子。作為動(dòng)植物體內(nèi)的重要調(diào)控分子，miRNA主要通過(guò)翻譯抑制、mRNA降解以及由其引導(dǎo)快速脫腺苷化作用起始的mRNA衰變等方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［1］。由于miRNA較為穩(wěn)定，相對(duì)于mRNA不容易被降解等特性，使得其成為具有良好臨床應(yīng)用潛能的分子標(biāo)志物。

臨床疾病標(biāo)本的應(yīng)用，在驗(yàn)證miRNA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制中具有非常重要的價(jià)值。然而，常規(guī)收集的、不論是新鮮標(biāo)本或福爾馬林固定石蠟包埋的臨床組織標(biāo)本，都存在因組織標(biāo)本的異質(zhì)性和缺乏miRNA定位信息而使得研究并不容易獲得滿(mǎn)意的結(jié)果。為此，建立并應(yīng)用具備定性、半定量以及定位信息的miRNA原位雜交（miRNA insitu hybridization，MISH）方法對(duì)臨床組織標(biāo)本進(jìn)行分析將為miRNA的研究帶來(lái)更多的便利。此項(xiàng)研究中，課題組選擇前期利用miRNA表達(dá)芯片篩選的miR－205作為研究靶點(diǎn)，建立并應(yīng)用原位雜交的方法對(duì)乳腺組織芯片標(biāo)本進(jìn)行miR－205的表達(dá)分析，以驗(yàn)證miR－205與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

材料和方法

1．組織芯片

人乳腺組織芯片購(gòu)自西安艾麗娜生物技術(shù)有限公司（編號(hào)BR723），共71例／72點(diǎn)。71例病人均為女性，年齡18－83歲，中位年齡45歲。其中正常與乳腺良性病變36點(diǎn)，包括正常乳腺組織2點(diǎn)，癌旁正常乳腺組織3點(diǎn)，腺病9點(diǎn)，纖維腺瘤4點(diǎn)，乳腺增生病變18點(diǎn)；乳腺癌36點(diǎn)，包括導(dǎo)管原位癌3點(diǎn)，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌18點(diǎn)，髓樣癌3點(diǎn)，粘液癌3點(diǎn)，小葉癌3點(diǎn)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移癌6點(diǎn)。芯片上的組織均經(jīng)常規(guī)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，5μm厚度切片，直徑1．5mm。

2．原位雜交

miR－205原位雜交檢測(cè)試劑盒購(gòu)自丹麥Exiqon公司，原位雜交封閉液與洗滌液購(gòu)自美國(guó)Roche公司?；具^(guò)程如下：組織芯片脫蠟，于37℃蛋白酶K消化15min，漂洗后梯度乙醇脫水。55℃預(yù)雜交30min后，地高辛標(biāo)記的 miR－205探針（100nmol／L）恒溫雜交1h，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗地高辛抗體室溫孵育1h，NBT／BCIP黑暗處30℃顯色，核固紅復(fù)染。雜交過(guò)程選擇U6探針（1nmol／L）作為陽(yáng)性對(duì)照，去除探針作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：miR－205呈藍(lán)色或藍(lán)紫色顆粒的陽(yáng)性信號(hào)定位于乳腺腺上皮或癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中；U6呈藍(lán)色或藍(lán)紫色顆粒的陽(yáng)性信號(hào)定位于乳腺導(dǎo)管上皮或間質(zhì)細(xì)胞的胞核。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞著色的范圍分為：陽(yáng)性細(xì)胞＜10%為0分；陽(yáng)性細(xì)胞≥10%為1分；按著色細(xì)胞染色強(qiáng)度分為：無(wú)表達(dá)或弱表達(dá)為0分，中等強(qiáng)度或強(qiáng)表達(dá)為1分。以上兩項(xiàng)積分相乘，積分為0分表示陰性（－），積分為1分表示陽(yáng)性（＋）。組織芯片的染色結(jié)果由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立鏡檢和評(píng)分。

3．細(xì)胞培養(yǎng)

9株人乳腺細(xì)胞均由美國(guó)佐治亞醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究中心石慧東副教授饋贈(zèng)，包括高度惡性人乳腺癌細(xì) 胞 株 BT549、 HS578T、 MDA－MB－231 和SUM159PT；低度惡性人乳腺癌細(xì)胞株 MDA－MB－468、T－47D、ZR－75－1和SKBR3以及永生化正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF10A。8株乳腺癌細(xì)胞均選擇含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MCF10A則用含5%馬血清、表皮生長(zhǎng)因子（20ng／mL）、胰島素（10μg／mL）、霍亂毒素（100ng／mL）和皮質(zhì)醇（500ng／mL）的DMEM／F12培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4．miRNA提取、逆轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)定量PCR

miRNA 提 取 按 照 mirVanaTMmiRNA Isolation Kit（Invitrogen，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。按照 RT2miRNA First Strand Kit（SA Biosciences，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)，取1μg miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。按照RT2SYBR Green Master Mixes（SABiosciences，美國(guó)）的操作說(shuō)明，以U6為 內(nèi) 參 照，使 用 Light Cycler 480II instrument（Roche，瑞士）進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)孔。U6、miR－205引物均購(gòu)自美國(guó)SABiosciences公司。采用公式2－ΔCt（ΔCt＝ Ct（miR－205）– Ct（U6））計(jì)算 miR－205的相對(duì)表達(dá)量。

5．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料率的比較采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05。

結(jié) 果

1．miR－205的原位雜交分析

乳腺組織原位雜交后，陰性對(duì)照結(jié)果未見(jiàn)藍(lán)色顆粒；U6探針雜交結(jié)果顯示呈藍(lán)紫色顆粒的陽(yáng)性信號(hào)定位于乳腺導(dǎo)管上皮或間質(zhì)細(xì)胞的胞核；miR－205探針雜交結(jié)果顯示呈藍(lán)紫色顆粒的陽(yáng)性信號(hào)定位于乳腺導(dǎo)管上皮或癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞核。結(jié)果見(jiàn)圖1、2。36例正常與良性乳腺病變中，33例（91．67%）積分為1分，為表達(dá)陽(yáng)性（＋）；36例乳腺癌中，23例（63．89%）積分為1分，為表達(dá)陽(yáng)性（＋）。miR－205的表達(dá)在乳腺良惡性病變中的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0．011），結(jié)果見(jiàn)表1。miR－205的表達(dá)與乳腺癌TNM分期、臨床分期無(wú)關(guān)（P＞0．05）。

表1 miR－205在正常、良性乳腺病變和乳腺癌中的表達(dá)Table 1 miR－205expression in normal tissues，benign tumors and malignant breast cancer

2．miR－205在乳腺細(xì)胞株中的表達(dá)

采用 mirVanaTMmiRNA Isolation Kit試劑盒分別提取的總RNA和小分子量RNA，經(jīng)1%瓊脂糖電泳顯示，總RNA泳道中大分子量的28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，5SrRNA等小分子量RNA的條帶較弱；小分子量RNA泳道中只存在5S rRNA等小分子量RNA，條帶較總RNA泳道中的小分子量RNA條帶清晰。結(jié)果見(jiàn)圖3。實(shí)時(shí)定量RT－PCR結(jié)果顯示，四個(gè)高度惡性乳腺癌細(xì)胞株（MDA－MB－231、HS578T、BT549 和 SUM159PT）中miR－205的表達(dá)較四個(gè)低度惡性細(xì)胞株（MDA－MB－468、T－47D、ZR－75－1和SKBR3）和永生化正常乳腺上皮細(xì)胞株 MCF10A中為低（P＜0．05）（圖4）。

圖1 乳腺組織中陰性對(duì)照、U6、miR－205探針的原位雜交（SP×100，NBT／BCIP顯色）圖2 組織芯片miR－205原位雜交（NBT／BCIP顯色）圖3 細(xì)胞總RNA（aRNA）與小分子量RNA（sRNA）的瓊脂糖凝膠電泳分析圖4 實(shí)時(shí)定量 RT－PCR檢測(cè)正常乳腺上皮 MCF10A和低度惡性（MDA－MB－468、T－47D、ZR－75－1和SKBR3）、高度惡性（MDA－MB－231、HS578T、BT549和SUM159PT）乳腺癌細(xì)胞株中 miR－205的表達(dá)Fig．1In situ hybridization analysis for negative，U6，miR－205in breast tissue（SP×100，NBT／BCIP solution）Fig．2In situ hybridization for miR－205in tissue array（NBT／BCIP solution）Fig．3Agarose gel electrophoresis analysis for total RNA （aRNA）and small molecular RNA （sRNA）Fig．4qRT－PCR detection for miR－205expression in normal breast epithelial cell MCF10A，less aggressive （MDA－MB－468，T－47D，ZR－75－1and SKBR3）and aggressive（MDA－MB－231，HS578T，BT549and SUM159PT）breast cancer cell lines

討 論

課題組前期利用miRNA表達(dá)芯片，在高度惡性、正常與低度惡性的12個(gè)乳腺細(xì)胞株中，共篩選到9個(gè)差異表達(dá)的miRNAs（P＜0．01，倍數(shù)值≥20或≤－20）。與正常、低度惡性細(xì)胞株相比，miR－205的表達(dá)在高度惡性乳腺癌細(xì)胞株中明顯下調(diào)［2］。為此，課題組選擇9個(gè)乳腺細(xì)胞株檢測(cè)miR－205的表達(dá)以驗(yàn)證芯片分析結(jié)果。實(shí)時(shí)定量RT－PCR結(jié)果顯示，四個(gè)高度惡性乳腺癌細(xì)胞株中miR－205的表達(dá)較四個(gè)低度惡性細(xì)胞株和永生化正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF10A中為低（P＜0．05），這與多數(shù)研究分析結(jié)果一致［3－5］。為進(jìn)一步驗(yàn)證 miR－205與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，選擇乳腺臨床標(biāo)本進(jìn)行miR－205的表達(dá)分析甚為必要。

在組織標(biāo)本中常用的低通量miRNA檢測(cè)方法主要是Northern blotting和實(shí)時(shí)定量RT－PCR。作為經(jīng)典的miRNA表達(dá)分析方法，Northern blotting是miRNA檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法主要通過(guò)熒光或放射性寡核苷酸探針與靶miRNA雜交以檢測(cè)目的miRNA的表達(dá)情況［6］，因其檢測(cè)中未經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增而能準(zhǔn)確反映組織樣品的實(shí)際miRNA含量，在miRNA研究的初期被廣泛應(yīng)用。然而，盡管經(jīng)過(guò)多次改良，該方法仍無(wú)法完全避免樣本需求量大、耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等缺點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量RT－PCR法是現(xiàn)階段使用最為普遍的方法。以較為先進(jìn)的stemloop RT－PCR為例，該方法不僅特異性高，可精確區(qū)分同一家族中序列高度同源性的miRNA，并能檢測(cè)只有一個(gè)堿基差別的不同miRNA的表達(dá)水平，而且該方法靈敏度也很高，樣品消耗量少，能檢測(cè)出低豐度靶miRNA［7］。然而，由于該方法可能因?yàn)镻CR擴(kuò)增后而失真miRNA表達(dá)結(jié)果以及組織標(biāo)本異質(zhì)性的特點(diǎn)，并不容易獲得滿(mǎn)意的結(jié)果。

因定性并半定量反映miRNA的表達(dá)，原位雜交在組織標(biāo)本的miRNA研究中可以帶來(lái)更多的便利。Qi等［8］應(yīng)用miRNA原位雜交的方法，針對(duì)乳腺正常導(dǎo)管上皮組織、異型扁平上皮組織、原位導(dǎo)管癌及浸潤(rùn)型導(dǎo)管癌組織分析發(fā)現(xiàn)，組織惡性程度越高，miR－21的表達(dá)越高。Li等［9］通過(guò)建立熒光原位雜交方法對(duì)miR－375進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，該方法不僅在食管癌細(xì)胞株miR－375的表達(dá)分析中與實(shí)時(shí)定量RT－PCR得出一致的結(jié)果，而且利用該方法還能有效地對(duì)食管癌組織芯片標(biāo)本進(jìn)行分析。為此，課題組成功建立并應(yīng)用原位雜交的方法在乳腺標(biāo)本上進(jìn)行了miR－205的表達(dá)分析。雜交結(jié)果顯示miR－205主要表達(dá)在乳腺腺上皮的胞質(zhì)與胞核，且miR－205的表達(dá)與乳腺病變良惡性相關(guān)（P＝0．011），在惡性病變中的表達(dá)低于正常與良性乳腺病變。該分析結(jié)果不僅驗(yàn)證了在不同惡性程度乳腺細(xì)胞株上的miRNA芯片與實(shí)時(shí)定量RT－PCR的檢測(cè)結(jié)果，也與大多數(shù)應(yīng)用其他方法在乳腺癌標(biāo)本上的分析結(jié)果一致。Savad［10］與 Wu［3］課題組通過(guò)實(shí)時(shí)定量 RTPCR方法分別對(duì)17例和19例臨床標(biāo)本分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌標(biāo)本中miR－205的表達(dá)低于配對(duì)癌旁組織。Iorio等［11］利用 Northern blotting方法發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中miR－205表達(dá)明顯低于對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織。對(duì)組織芯片中36例乳腺癌標(biāo)本的原位雜交結(jié)果分析顯示，miR－205的表達(dá)與病例年齡、乳腺癌TNM分期、臨床分期均無(wú)相關(guān)性（P＞0．05）。該結(jié)果與Liu等［12］對(duì)20例乳腺癌病人的血清miR－205表達(dá)與病例資料分析結(jié)果一致。然而，Baffa等［13］采用miRNA芯片對(duì)13例原位乳腺癌及其對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，miR－205的表達(dá)在轉(zhuǎn)移灶中明顯下調(diào)。產(chǎn)生這種差異的原因，可能與miR－205表達(dá)檢測(cè)的方法、病例來(lái)源以及病例樣本偏小等諸多因素有關(guān)。

在臨床標(biāo)本上驗(yàn)證miRNA與其調(diào)控基因的關(guān)系是miRNA功能分析的重要環(huán)節(jié)。Laura Gramantieri等［14］在細(xì)胞水平上成功驗(yàn)證 miR－122a和周期蛋白G1的調(diào)控關(guān)系后，通過(guò)Northern blotting和免疫印跡的方法對(duì)肝細(xì)胞癌臨床標(biāo)本中的miR－122a和周期蛋白G1分別進(jìn)行了表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者表達(dá)在同一標(biāo)本中呈現(xiàn)明顯反變的關(guān)系。然而，因操作繁瑣和組織異質(zhì)性等原因，選擇Northern blotting或?qū)崟r(shí)定量RT－PCR在高通量臨床樣本中驗(yàn)證miRNA及其靶點(diǎn)的調(diào)控關(guān)系較在細(xì)胞水平上的驗(yàn)證更為困難。原位雜交結(jié)合連續(xù)切片免疫組化分析在組織樣本中驗(yàn)證miRNA的靶點(diǎn)調(diào)控顯現(xiàn)出較其他方法更大的優(yōu)勢(shì)。Yamamichi等［15］采用原位雜交與免疫組化相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)miR－21在結(jié)腸癌組織中表達(dá)量高于正常結(jié)腸組織，而PDCD4的表達(dá)情況相反，兩者的表達(dá)定位存在明顯的反相關(guān)系。結(jié)合細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)，在臨床標(biāo)本上進(jìn)一步驗(yàn)證了PDCD4是miR－21靶點(diǎn)的可能。這為miRNA原位雜交方法在臨床標(biāo)本上的廣泛應(yīng)用提出了更迫切的需求。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為miR－205可能參與乳腺癌病變的發(fā)生、發(fā)展并在乳腺良性病變、癌變及其演進(jìn)過(guò)程中呈明顯下調(diào)傾向；原位雜交方法的應(yīng)用為闡明miRNA的作用機(jī)制提供了更為便利的條件。盡管本課題對(duì)miR－205在乳腺細(xì)胞株與乳腺疾病組織標(biāo)本進(jìn)行了表達(dá)分析，但組織標(biāo)本的數(shù)量仍然較少，將實(shí)驗(yàn)結(jié)論在更多乳腺組織標(biāo)本的驗(yàn)證仍然非常必要；同時(shí)，如何將細(xì)胞水平篩選的miR－205靶點(diǎn)應(yīng)用原位雜交結(jié)合免疫組化方法驗(yàn)證兩者之間的關(guān)系，也為后續(xù)工作提供了方向。

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