董睿敏 鄭振達(dá) 謝旭晶 朱潔明 趙長(zhǎng)林 陳 璘

（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科，廣州510630）

肌聯(lián)蛋白（titin）是一個(gè)肌小節(jié)蛋白，發(fā)現(xiàn)相對(duì)較晚，但功能重要［1，2］。Titin是哺乳動(dòng)物體內(nèi)分子量最大的蛋白，隨亞型結(jié)構(gòu)不同分子量達(dá)2970－3700kDa［3］。Titin的 N－C末端跨越半個(gè)肌小節(jié)，N末端與肌動(dòng)蛋白相互作用固定于Z線，C末端附著在M線的肌球蛋白上。Titin的發(fā)現(xiàn)是對(duì)滑行肌絲模型理論（sliding filament model）的重要補(bǔ)充，是肌原纖維中的“第三肌絲”。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有利于維持肌原纖維的完整性和穩(wěn)定性，為粗肌絲裝配的模版蛋白［4，5］。并且，titin的I帶部分具有高度折疊的彈簧樣分子結(jié)構(gòu)，是心肌細(xì)胞執(zhí)行舒張功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［1，2］。Titin在心肌細(xì)胞中同時(shí)表達(dá) N2B 和N2BA兩種亞型，N2B更短更僵硬，N2BA更長(zhǎng)更有彈性，在不同的種屬、不同的發(fā)育階段和病理狀態(tài)下，N2B／N2BA比值變化，可導(dǎo)致心臟僵硬度發(fā)生明顯的改變［6］。為研究titin的生理病理功能，需對(duì)titin及其亞型進(jìn)行有效的電泳分離。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE）是分離鑒別蛋白的重要實(shí)驗(yàn)方法，但該方法不能有效地分離大于500KDa的大分子量蛋白，對(duì)于超大分子量的titin而言需要特殊的電泳技術(shù)［7］。本試驗(yàn)為能同時(shí)有效地分離肌小節(jié)內(nèi)的超大分子量蛋白titin各亞型和中分子量的肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain，MHC），增強(qiáng)titin研究的可行性和科學(xué)性，對(duì)其電泳方法進(jìn)行了改良。采用大面積垂直電泳，在電泳板上層以SDS－瓊脂糖膠（SDS－agarose gel electrophoresis，SDS－VAGE）方法分離titin各亞型，下層以SDS－PAGE電泳分離MHC，建立了能夠同時(shí)分離、檢測(cè)分子量跨越范圍大的多個(gè)蛋白的一步法電泳。

材料和方法

1．材料

1．1儀器與試劑

DYY－60型電泳儀；16cm×18cm垂直凝膠電泳槽（Bio－rad，美國(guó)）；凝膠成像系統(tǒng)（KODAK，美國(guó)）；瓊脂糖（SeaKem Gold AGAROSE，Sigma，美國(guó)）；四甲基乙二銨（Sigma，美國(guó)）；丙烯酰胺、硝酸銀、硅鎢酸、冰醋酸、甲醛、甘油、甘氨酸、十二烷基苯磺酸鈉（SDS）、三羥甲基氨酸甲烷（Tris）、過(guò)硫酸銨（Aps）等。

1．2實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)兔和小鼠，均于麻醉后迅速摘取心臟，用冰生理鹽水沖洗，沿房室環(huán)剪去左右心房及右室游離壁，然后切取左心，心尖至心底連線中點(diǎn)處游離壁心肌組織，置液氮保存后轉(zhuǎn)移至－80℃低溫冰箱以備做。同樣方法留取兔腓腸肌組織。

2．方法

2．1總蛋白提取

取少量的上述的兔心肌組織、小鼠心肌組織，兔腓腸肌組織。將各組標(biāo)本分別置于預(yù)冷的研缽中，在液氮浸泡下將組織塊研磨成粉狀。將粉狀組織分裝入EP管中，并按1∶40移入裂解液。60℃加熱10min。渦旋后，在13 200r／min離心5min，取上清即行電泳。

2．2垂直凝膠板的制備

將兩塊16cm×18cm的垂直電泳玻板和齒梳洗凈后，再用酒精擦拭，晾干，安裝在配膠架上。

2．2．1配制PAGE膠

先配制15ml 6%的PAGE膠，配方如下：30%丙烯酰胺溶液3ml、2mol／L Tis（pH 8．8）5．7 ml、甘油0．15ml、Aps 0．15ml、去離子水6ml、TEMED 0．012ml、SDS 0．15ml。配置后立即混勻，迅速將配置好的PAGE膠灌注到兩塊玻璃板中間的間隙中，小心地用雙蒸水覆蓋，室溫垂直放置1h使之凝固。PAGE膠高度約占整片垂直電泳膠的1／3，主要起到分離中分子蛋白 MHC的作用，同時(shí)可防止在垂直電泳中上層VAGE膠從底部脫落。待PAGE膠聚合完成后，倒掉覆蓋層，盡可能排去凝膠上的液體，用吸水紙吸干。并將帶有PAGE膠的垂直電泳槽置于60℃烤箱中預(yù)熱約15min。

2．2．2配制 VAGE膠

VAGE膠灌注在PAGE膠上方，約占整片垂直電泳膠的2／3，主要起到分離巨大分子titin亞型的作用。按照下述方法配制50ml 1%的VAGE膠：100%甘油15ml，5＃buffer（0．25mol／L Tris，1．92mol／L甘氨酸，0．5%SDS）10ml，去離子水定容至50ml。秤取瓊脂糖0．5g，將上述50ml溶液溶解瓊脂糖。反復(fù)煮沸，使瓊脂糖充分溶解。其后將瓊脂糖液置入60℃烤箱10min，以排除液體中的氣泡。將1%VAGE膠直接灌注到已預(yù)熱的垂直電泳槽中，灌注后再次放入60℃烤箱5－10min，使液狀膠體中的氣泡能上升至液面。取出已灌注的垂直電泳槽，排除氣泡后，立即在其中插入一塊干凈的齒梳。室溫冷卻后置于4℃冰箱制冷，至少放置30 min后方能行電泳。也可于4℃冰箱中放置不超過(guò)2d。

2．3點(diǎn)樣

待VAGE膠聚合冷卻后，小心移去齒梳。將凝膠固定在電泳裝置上，分別在上下電泳槽加入蛋白質(zhì)電泳緩沖液，緩沖液配方：50mmol／L Tris，0．384 mol／L甘氨酸，0．1%SDS，上槽中需添加0．08%2－巰基乙醇。排除氣泡后按照預(yù)定順序每個(gè)樣品上樣10μl，不用上樣的空孔加入等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液。

2．4電泳

在恒溫4℃下進(jìn)行電泳。接通電源，設(shè)定電壓為200－250v，恒定電流15mA。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)下層PAGE膠體底部時(shí)，可停止電泳，約需持續(xù)電泳5h。卸下玻板，在緩和的流水中輕輕撬開(kāi)，取出凝膠。小心分離出下層的PAGE膠和上層的VAGE膠。

2．5染色

PAGE膠使用考馬斯亮藍(lán)染色法：用至少5倍體積的考馬斯亮藍(lán)R250染色液浸泡PAGE膠，室溫下置于搖床上平緩搖動(dòng)1h。將凝膠移入脫色液中，室溫平緩搖動(dòng)4－8h，其間更換脫色液2－3次；VAGE膠使用銀染法：使用100ml固定液浸泡VAGE膠，室溫下置于搖床上平緩搖動(dòng)1h。棄除固定液后，置膠片于37℃溫箱中18－20h，使膠片中水分減少，膠片變薄可降低銀染時(shí)背景對(duì)結(jié)果觀察的影響。蒸餾水搖晃洗滌20min×3次。2%亞鐵氰化鉀浸泡5min后，蒸餾水搖晃洗滌5min×3次。100ml新鮮配制的銀染液染色，待蛋白條帶出現(xiàn)即倒掉銀染液，予1%冰乙酸液洗膠，中和停止銀染反應(yīng)。

2．6上述凝膠均于染色后即掃描記錄，使用Bandscan分析軟件對(duì)目標(biāo)條帶行蛋白定量。

結(jié) 果

Titin為動(dòng)物體內(nèi)分子量最大的蛋白，使用SDS－VAGE電泳并銀染可見(jiàn)titin的蛋白條帶處于膠片的最頂端。Titin具有數(shù)個(gè)亞型，亞型的數(shù)量比例在不同的物種中差別甚遠(yuǎn)。因?yàn)橥秒枘c肌titin基本為N2A亞型，鼠心肌titin 99%為N2B亞型，所以可使用這兩種組織的titin電泳條帶作為titinN2A和N2B亞型的標(biāo)記［7］。蛋白電泳結(jié)果顯示：采用改良后的電泳方法，上層SDS－VAGE膠能成功分離titin，銀染后可清晰顯示titin各亞型及其分解產(chǎn)物T2。使用兔腓腸肌作為titin N2A標(biāo)記，鼠心肌作為titin N2B標(biāo)記，可確定兔心肌細(xì)胞分離出N2B和N2BA亞型，titin各亞型相應(yīng)條帶所處位置與其分子量大小一一對(duì)應(yīng)（圖1）。

圖1 SDS－VAGE電泳并銀染分離titin各亞型Fig．1SDS－agarose （SDS－VAGE）gel electrophoresis．RB SO，rabbit soleus．RT LV，rat left ventricle．RB LV1－4，rabbit left ventricle．The rabbit cardiac samples contain N2BA and N2Bisoforms whereas the rabbit skeletal samples contain onlyN2Aypef．

上層SDS－VAGE膠經(jīng)銀染處理后明顯變薄并收縮，可減少銀染時(shí)背景染色過(guò)深導(dǎo)致條帶分析困難。上層的VAGE膠與下層的PAGE膠連接良好（圖2）。與標(biāo)記蛋白對(duì)照，可見(jiàn)下層SDS－PAGE膠能清晰地分離出MHC。根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，使用銀染法能提高titin蛋白條帶的檢出率。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)如同時(shí)使用銀染法標(biāo)記MHC其條帶染色彌散，背景較深，影響電泳圖像分析。故對(duì)SDS－PAGE膠使用考馬斯藍(lán)染色，結(jié)果顯示MHC條帶顯示清晰（圖2）。

圖2 SDS－VAGE結(jié)合SDS－PAGE的16cm×18cm垂直電泳。Fig．2 16cm×18cm vertical gel electrophoresis combining SDS－VAGE and SDS－PAGE．RB SO，rabbit soleus．RT LV，rat left ventricle．RB LV，rabbit left ventricle．MHC，myosin heavy chain．The top SDS－VAGE gel help to resolve titin isoforms and the bottom SDS－PAGE gel can separate MHC．This design allows to resolve titin isoforms and MHC in one step and one gel．

討 論

SDS－PAGE是分析生物體蛋白常用的方法，其基本原理在于：使用化學(xué)物消除蛋白的電荷差，由蛋白分子量的大小決定電泳遷移率，實(shí)現(xiàn)蛋白分離。不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠形成不同凝膠孔徑，與相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子大小接近，可提高對(duì)蛋白的分辨能力。大部分的生物體蛋白可通過(guò)SDS－PAGE被分離、鑒定和純化，但對(duì)于大分子量的蛋白，使用常規(guī)的電泳分離效果差。大分子量蛋白，需要低濃度的聚丙烯酰胺凝膠，低濃度的凝膠接近液態(tài)狀，機(jī)械強(qiáng)度低，不利于實(shí)驗(yàn)操作，同時(shí)在固定與染色階段容易出現(xiàn)膠體的斷裂和破碎，影響實(shí)驗(yàn)效果。

Titin分子量巨大，其蛋白電泳方法是研究的難點(diǎn)，同時(shí)也導(dǎo)致了titin研究受到限制。既往使用的分離titin的電泳方法是用低濃度或2%－9．5% 濃度漸變SDS－PAGE膠進(jìn)行電泳［6］。但這些方法均不能克服低濃度的PAGE膠帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)困難，如：膠片制作困難；實(shí)驗(yàn)操作中膠片容易破損；titin亞型的分離效果欠佳；轉(zhuǎn)膜效率低而難以行下一步的western blot檢測(cè)。至2003年Warren等使用1%SDS－瓊脂 糖 膠 （SDS－agarose gel electrophoresis，SDS－VAGE）垂直電泳可清晰地分離titin的各種亞型，并證實(shí)該電泳系統(tǒng)可應(yīng)用于大分子量蛋白（≥220kDa）的分離［7］。

根據(jù)上述方法進(jìn)行改良的垂直電泳方法，電泳膠片分為兩大部分：上2／3使用SDS－VAGE膠對(duì)titin進(jìn)行分離及銀染；下1／3采用SDS－PAGE膠對(duì)MHC進(jìn)行分離并予考馬斯藍(lán)染色。在上部的VAGE膠中因?yàn)榄傊切纬傻目讖酱?，?duì)于超大分子量的titin蛋白而言是良好的電泳介質(zhì)。Titin在SDS－VAGE膠中緩慢移動(dòng)，電泳約5小時(shí)可實(shí)現(xiàn)亞型的分離。對(duì)中小分子量的蛋白而言，上層的VAGE膠相當(dāng)于不連續(xù)電泳系統(tǒng)中的低濃度的濃縮膠。中小分子量的蛋白在SDS－VAGE膠中電遷移速度快，有利于這些蛋白從最初的樣品溶液中濃縮出來(lái)，進(jìn)而在下部的SDS－PAGE膠中實(shí)現(xiàn)電泳分離。一步法的垂直電泳方法有助于在實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)一次電泳同時(shí)分離多個(gè)分子量差距大的蛋白，提高實(shí)驗(yàn)效率。此方法也有利于titin的研究，因?yàn)閠itin極易出現(xiàn)降解，無(wú)法制備相關(guān)的獨(dú)立標(biāo)記蛋白，故使用內(nèi)參的方法對(duì)titin進(jìn)行定量檢測(cè)更為準(zhǔn)確［8］。在本實(shí)驗(yàn)中可以 MHC作為內(nèi)參，總titin＝N2B＋N2BA＋T2，titin總量可表達(dá)為總titin／MHC。

此外，使用上述兩種膠體結(jié)合的大面積垂直電泳也有助于提高蛋白含量測(cè)定的精確性。因?yàn)榈鞍纂娪咀鳛橐环N操作技術(shù)，在試驗(yàn)過(guò)程中有多方面的因素可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如：標(biāo)本的準(zhǔn)備方法；凝膠的組成和濃度；電泳分離參數(shù)和染色條件等。總體而言，蛋白定量檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)注意使用同等條件準(zhǔn)備標(biāo)本、進(jìn)行電泳及分析。本實(shí)驗(yàn)采用的垂直電泳板面積為16cm×18cm，共有21個(gè)點(diǎn)樣孔，允許多個(gè)標(biāo)本同時(shí)電泳。并可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)膠體進(jìn)行組合，一次電泳即可檢測(cè)出標(biāo)本中的多個(gè)目標(biāo)蛋白，減少分次電泳中存在的不可控誤差，提高了結(jié)果比較和分析的可靠性。

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