黃 焱 鄭衛(wèi)東，＊ 修惠平 謝茂松， 曾賽凡

（福建醫(yī)科大學(xué)1醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院眼視光學(xué)系，福州350004；2附屬第一醫(yī)院眼科；3附屬第一醫(yī)院病理科，福州350005）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的致盲性并發(fā)癥，但是視皮質(zhì)病變在糖尿病視功能損害中的作用研究較少。大量研究表明高血糖導(dǎo)致組織損傷的最重要的作用機制是：高級糖基化終末產(chǎn)物（Advanced glycosylation end products，AGEs）堆積，AGEs通過與內(nèi)皮細胞、單核巨噬細胞等細胞膜上的特異性高級糖基化終末產(chǎn)物受 體 （Receptor for advanced glycosylation end products，RAGE）結(jié)合而引起細胞因子、激素、氧自由基等可溶性信號物質(zhì)含量的改變，導(dǎo)致多種蛋白質(zhì)基因表達水平的改變［1］。AGEs過量堆積與DR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2］。邢影等研究發(fā)現(xiàn)AGEs和RAGE表達的明顯增加對糖尿病大鼠腦組織缺血性損傷起一定的作用［3］。本研究通過熒光免疫學(xué)方法對糖尿病大鼠視皮質(zhì)中AGEs－RAGE的分布作定性定量研究，同時觀察AGEs的抑制劑吡哆胺是否有保護作用，為糖尿病導(dǎo)致視功能損害的早期防治提供新的策略。

材料和方法

1．實驗動物和分組

健康雄性SD（Sprague dawley）大鼠80只，體重200－220g（上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號（SCXK－2007－006）。飼養(yǎng)于清潔實驗室，自由飲水，飲食。運用隨機數(shù)字表方法分為正常對照組（NC組）、糖尿病未治療組（DM組）、糖尿病吡哆胺治療組（PM組）和氨基胍治療對照組（AG組），每組各20只。

2．模型的制作

NC組以0．1mmol／L檸檬酸緩沖液進行腹腔注射，正常環(huán)境下飼養(yǎng)。其余各組大鼠以鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）制作糖尿病模型［2］，STZ臨用前以0．1mol／L檸檬酸緩沖液（pH 4．2－4．5）配成1%濃度，經(jīng)微孔濾膜過濾滅菌，按65mg／kg一次性左下腹腔注射。72h后取尾靜脈血測空腹血糖。凡血糖≥16．7mmol／L為誘導(dǎo)成功的糖尿病大鼠，NC組和DM組每天生理鹽水灌胃，AG組每天氨基胍100mg／kg灌胃［2］，PM 組每天吡哆胺200mg／kg灌胃，第4w、12w取材用于下述實驗。

3．主要試劑及儀器

STZ（批號：S0130，純度≥98．89%，美國Sigma公司），吡哆胺（批號：33201006，純度≥98%，美國Sigma公司）和鹽酸氨基胍（批號：143413－15531AH，美國Sigma公司）。大鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物酶聯(lián)免疫（ELISA）分析試劑盒（批號：PE10163R，美國Assay公司）。兔抗人RAGE抗體（BA1789，博士德生物工程有限公司）和FITC標(biāo)記羊抗兔試劑（BA1105，博士德生物工程有限公司）。酶 標(biāo) 儀 （ELX800，德 國 Berthold Detection systems）；光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)（（BH－2，日本 Olympus公司）。用羅氏血糖儀監(jiān)測血糖。

4．酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測

大鼠飼養(yǎng)至成模后第12周，麻醉、固定、開顱，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜［3］在大腦縱裂外側(cè)1mm，冠狀切取距離前囟后方4．8mm開始向后3mm厚右側(cè)視皮質(zhì)部位的腦組織。將分離出的視皮質(zhì)稱重，制成10%視皮質(zhì)勻漿。4℃，3000rpm，離心20min，取上清液。應(yīng)用雙抗體夾心法（ELISA試劑盒）測定大鼠視皮質(zhì)AGEs水平。按試劑盒說明書操作，每個標(biāo)本做三復(fù)孔檢測。

5．免疫熒光染色

同上述方法，冠狀切取左側(cè)視皮質(zhì)部位的腦組織，置于適量OCT膠的冷凍托中央，周圍再用膠水封住，放在冰凍切片機（SYD－K2040沈陽譽德電子儀器有限公司）的冰凍臺上將其進一步冰凍，3min后切片，溫度為－20℃，切片厚度10μm。并立即置于裝有4℃4%多聚甲醛的臥式染缸固定30min，用PBS洗3×3min，加RAGE抗體（濃度1∶100），室溫下孵育30min，用PBS洗3×3min。加熒光FITC標(biāo)記試劑（1∶64），室溫下孵育20min，吸干組織周圍液體，防淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察不同處理組視皮質(zhì)RAGE的表達，每張切片取3個視野進行攝片對照，用美國顯微鏡圖像分析軟件（imageproplus，ipp）進行平均光密度分析。

6．統(tǒng)計學(xué)分析方法

用SPSS17．0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用ˉx±s表示，視皮質(zhì)AGEs的含量和RAGE的平均光密度采用單因素方差分析的雙向分類的方差分析，組間的比較采用LSD－t檢驗，以P＜0．05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．一般情況

與NC組大鼠比較，模型組（DM組、PM組、AG組）大鼠逐漸出現(xiàn)尿量增加，飲水飲食也隨之增多，隨病程延長多飲多食多尿癥狀更加明顯；逐漸出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，體毛聳立松散、毛色泛黃。12周各組大鼠體重、血糖情況（見表1）

表1 12周各組大鼠體重、血糖情況Table 1 The weight and blood glucose of rats 12weeks

2．各組大鼠視皮質(zhì)中AGEs的含量變化（見圖1）

正常大鼠視皮質(zhì)存在較低的AGEs，造模4w時糖尿病各組視皮質(zhì)AGEs的含量顯著高于正常對照組（t＝4．699，P＜0．05），但是 AG組、PM 組與DM組之間的差異無顯著性。12w時DM組與4w組比較顯著升高，說明AGEs的含量升高隨病程延長而加重。PM組12周的大鼠視皮質(zhì)AGEs的含量較DM 組顯著降低（t＝5．385，P＜0．05），但是仍然顯著高于NC組（t＝3．767，P＜0．05）。PM 組與AG組比較差異始終無顯著性。

三．各組大鼠視皮質(zhì)RAGE的含量的變化

正常大鼠視皮質(zhì)由外向內(nèi)分為分子層、外顆粒層、錐體細胞層、內(nèi)顆粒層等，熒光染色顯示正常大鼠視皮質(zhì)各層RAGE僅少量表達，糖尿病大鼠視皮質(zhì)各層RAGE均高表達，吡哆胺和氨基胍治療組表達顯著降低，僅在II－IV層（外顆粒層、錐體細胞層）有表達（見圖2）。各組光密度度值比較見表2。

圖1 大鼠視皮質(zhì)AGEs含量（pg／ml）n＝10＊：與DM組、PM組、AG組比較差異有顯著性（P＜0．05）n＝10☆：12w的PM組、AG組與DM組比較差異有顯著性（P＜0．05）n＝10★：DM組的大鼠視皮質(zhì)AGEs12w比4w升高，差異有顯著性（P＜0．05）Fig．1The change of AGEs contents in visual cortex of each group rats（pg／ml）

表2 各組大鼠視皮質(zhì)RAGE陽性表達光密度值（n＝10）Table 2 OD of RAGE Positive express in visual cortex of different group rats（n＝10）

討 論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是致盲性的糖尿病眼部并發(fā)癥。早診斷早治療一直是國內(nèi)外研究的熱點。其中視覺誘發(fā)電位（Visual Evoked Potential，VEP）在DR早期診斷中的意義已有較多的報道［6］，圖形視覺誘發(fā)電位（pattern－Visual Evoked Potential，PVEP）是指視網(wǎng)膜受圖形刺激后在枕葉視皮層誘發(fā)的電活動，是一種非特異性檢查，它主要反映視網(wǎng)膜黃斑區(qū)、視神經(jīng)和視皮質(zhì)的功能。從視網(wǎng)膜到視皮質(zhì)任何部位神經(jīng)纖維病變都可以產(chǎn)生變異。P－VEP延長提示視功能損害，可作為DR病變早期診斷的一個指標(biāo)［7］。一些研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)眼底無明顯改變時視覺功能已經(jīng)發(fā)生了變化，而在此階段對視網(wǎng)膜的病變研究較多，視皮質(zhì)的病理機制研究少見報道。秦偉［8］等認(rèn)為高血糖可致糖尿病大鼠的視路上神經(jīng)元突觸密度和分布減少，同時可能會引起調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放功能的障礙，從而影響視路上的神經(jīng)傳導(dǎo)功能，引起視功能障礙。本研究用ELISA實驗檢測了大鼠視皮質(zhì)AGEs的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在糖尿病早期，視皮質(zhì)AGEs的含量就比正常對照組明顯增加。用免疫熒光檢測RAGE的表達也是增加，并且隨著病程延長而加重。根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果［8］：糖尿病大鼠視網(wǎng)膜AGEs的含量增加，其受體RAGE表達增強，因此，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜和視皮質(zhì)都發(fā)生了AGEs和RAGE系統(tǒng)的改變，糖尿病對視功能的影響如VEP的改變不僅僅是視網(wǎng)膜造成的，同時還存在視皮質(zhì)的病變。這也可以給Ozsoy［10］等提出的可以用 磁共振波譜檢測DR患者視皮質(zhì)內(nèi)的一些化合物和代謝物的含量的研究提供理論依據(jù)。

在生理狀態(tài)下，AGEs及其蛋白合成產(chǎn)物主要通過單核巨噬細胞的吞噬作用降解為可溶性的小分子多肽，經(jīng)腎臟及時清除，使體內(nèi)的AGEs含量保持平衡，但在糖尿病等病理狀態(tài)下該平衡被破壞，使AGEs生成增加在各組織器官積聚而致病。沉積在組織細胞上的AGEs能刺激其受體表達增加，兩者結(jié)合相互作用增加細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，激活多種關(guān)鍵性細胞信號途徑產(chǎn)生一系列細胞反應(yīng)，引起組織病理學(xué)改變，從而導(dǎo)致組織細胞的損傷［11］。對AGEs的形成進行抑制，并阻斷AGEs同其受體RAGE的相互作用，同時抑制RAGE所介導(dǎo)的信號路徑，就可能是對糖尿病眼部并發(fā)癥導(dǎo)致視功能障礙進行治療的關(guān)鍵。吡哆胺作為維生素B6的一種天然形式，可作為AGEs的抑制劑，和其他親核試劑一樣能清除非酶糖基化造成的活性羰基中間產(chǎn)物。在羥乙醛／乙二醛和核糖核酸酶的反應(yīng)中，吡哆胺起到了抑制賴氨酸殘基修飾、保護核糖核酸酶活性的作用。大量研究發(fā)現(xiàn)吡哆胺能顯著抑制AGEs的產(chǎn)生，趙麗艷［12］等也研究證實，吡哆胺能抑制糖基化反應(yīng)，對AGEs的形成有明顯抑制作用，其抑制作用隨劑量的增加效果明顯增強，從而阻斷AGE－RAGE相互作用激活細胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展進程。本課題組前期研究［9］發(fā)現(xiàn)單用吡哆胺、氨基胍治療4周后，兩組大鼠視皮質(zhì)AGEs含量與DM組相比無顯著差異（P＜0．01），12w后抑制作用比較顯著，提示吡哆胺和氨基胍抑制AGEs的形成，有一定的治療作用但是需要一段持續(xù)的治療；用吡哆胺灌胃治療糖尿病大鼠，12w后可減少視皮質(zhì)AGEs的堆積，降低RAGE表達，對糖尿病大鼠視皮質(zhì)具有一定的保護作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠視皮質(zhì)中AGEs含量和RAGE的表達高于正常對照組。吡哆胺類似氨基胍可減少AGEs的堆積，還能抑制RAGE的表達，減輕AGEs－RAGE通路作用導(dǎo)致的組織損傷，對視皮質(zhì)具有一定的保護作用。

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