謝 輝 唐成林 陳曉琳 唐念珍

（重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)藥研究室，重慶400016）

運(yùn)動損傷給人們帶來了很大程度的痛苦和精神負(fù)擔(dān)，其中骨骼肌損傷占了相當(dāng)大的比例。骨骼肌在劇烈運(yùn)動或急性損傷中會引起自由基的生成，使細(xì)胞膜的孔隙擴(kuò)大，通透性增加和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，甚至出現(xiàn)炎癥反應(yīng)和退行性變化；過量的自由基更會引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對骨骼肌造成進(jìn)一步傷害［1］。自由基（free radical）又稱游離基，是共價(jià)鍵發(fā)生均裂而形成的具有不成對電子的原子或基團(tuán)，如氫自由基、氯自由基、甲基自由基等。我們知道，自由基具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，它也參與了骨骼肌損傷的病理過程，因此現(xiàn)在人們對抗氧化，保護(hù)骨骼肌細(xì)胞，以及提高供氧水平等方面進(jìn)行的研究已成為了重要方向。

推拿按摩，因手法操作簡單、安全性高，對骨骼肌損傷的康復(fù)是一種最好的方法，近年來應(yīng)用廣泛。因骨骼肌損傷及其修復(fù)過程較復(fù)雜，本文通過建立兔骨骼肌鈍挫傷模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用HE染色、生化指標(biāo)檢測和熒光定量PCR技術(shù)，觀察骨骼肌挫傷愈合過程中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）、髓過氧化物酶（MPO）和細(xì)胞磷脂酶A2（PLA2）的變化，探討按摩在骨骼肌挫傷恢復(fù)過程中的作用及應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

1．實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

試劑：谷胱甘肽過氧化物酶測試盒（南京建成）、髓過氧化物酶測試盒（南京建成）；酶標(biāo)儀（RT－2100C，中國）；Triol總RNA提取試劑（天根生化科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）試劑盒（TaKaRa寶生物公司）儀器：MVIS－2022全自動血流變分析儀（重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司），8%硫化鈉脫毛劑，AFY－10按摩器（天津京康瑞?？萍及l(fā)展有限公司），自制軟組織打擊器，80－2型低速離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）。

2．實(shí)驗(yàn)動物及分組

純種健康成年雄性新西蘭大白兔42只，體重（2．0±0．5）kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（醫(yī)學(xué)動物合格證SCXK渝20120001）。將實(shí)驗(yàn)兔分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，隨機(jī)分為4組，正常對照組（A組，3只）、損傷組（即損傷后第3d，B組，3只）、按摩組（C組，分為損傷第5d和第10d按摩組，各9只）和自然恢復(fù)組（D組，分為損傷后第5d和第10d自然恢復(fù)組，各9只）。

3．實(shí)驗(yàn)方法

3．1制模

A組實(shí)驗(yàn)動物不予作任何處理，為正常對照；B、C、D組采用重物打擊法制作兔股四頭肌急性損傷模型［2］。重力打擊器為自制的底面平滑的重力鉛錘：錘長10cm、重0．5kg、直徑2．5cm；塑料導(dǎo)向管長100cm，直徑為3．0cm。具體操作如下：將每只家兔俯臥位固定，并于左后肢打擊部位墊一層紗布，防止皮膚破損；打擊時(shí)自由落高60cm，同一部位連續(xù)打擊3次，為保證每只實(shí)驗(yàn)兔所受撞擊力度和損傷范圍一致，每次的鉛錘投放和導(dǎo)管固定由同一人執(zhí)行。肉眼可見受打擊的部位出現(xiàn)腫脹和淤血，同肌肉撞傷相似，無皮膚破裂及骨折，表明造模成功。

3．2按摩干預(yù)

對按摩組于造模后第4d開始進(jìn)行按摩治療［3］，自然恢復(fù)組不進(jìn)行按摩。按摩儀器用北京瑞天盛達(dá)電器有限公司生產(chǎn)的RT－N2智能按摩器，按摩所用轉(zhuǎn)速為2600r／min，在受損組織及臨近部位直接按摩，每天1次，每次15min，兩組動物分別于傷后第4d進(jìn)行連續(xù)按摩，直至處死。

3．3取材

于損傷后第5d和第10d對實(shí)驗(yàn)兔取血液樣本。將兔仰位固定在兔盒內(nèi)，選取心臟搏動最明顯處進(jìn)行穿刺，部位約為第3肋間隙胸骨左緣3mm處。抽取3ml血放于潔凈試管中，室溫自然凝固15min，經(jīng)3 000r／min離心20min，收集上清，然后分裝于0．5ml的EP管內(nèi)，放置于－20℃低溫冰箱中保存，用以GSH－Px和MPO的生化指標(biāo)活力值檢測。

空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔?？焖偾腥≡炷Ｌ幑伤念^肌，預(yù)冷PBS清洗受損股四頭肌，縱向切取4塊標(biāo)本，將其中2塊約1．5cm×1．0cm×0．5cm標(biāo)本用4%多聚甲醛固定液固定過夜，便于進(jìn)行HE染色。另2塊約1．5cm×1．0cm×0．5cm馬上放入液氮中冷凍，轉(zhuǎn)移至－80℃低溫冰箱保存，進(jìn)行熒光定量PCR檢測PLA2mRNA。

3．4血清生化指標(biāo)檢測

集中血清，嚴(yán)格按照試劑盒上說明進(jìn)行GSHPx和MPO指標(biāo)檢測，通過公式進(jìn)行活力值計(jì)算。血清GSH－PX活力＝（非酶管OD值－酶管OD值）／（標(biāo)準(zhǔn)管OD值－空白管OD值）×樣本管濃度×稀釋倍數(shù)×樣本測試前稀釋倍數(shù)，MPO活力＝（測定OD值－對照 OD值）／（11．3×取樣量）

3．5實(shí)時(shí)熒光定量PCR

從－80℃冰箱中取出各組骨骼肌標(biāo)本0．1g，加液氮反復(fù)研磨數(shù)次，待標(biāo)本成粉末狀后加入1ml Trizol，按照試劑盒說明書提取總RNA。采用DNaseⅠ純化總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。取各組待測樣本cDNA 2？l，SYBR Real－time PCR Master Mix 12．5μl，上、下游引物各1 μl，去 離 子 水 8．5μl，總 反 應(yīng) 體 系 為 25μl。 在MX3005P型熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增及熒光定量檢測，檢測指標(biāo)包括PLA2及內(nèi)參基因（Action）的擴(kuò)增情況。引物設(shè)計(jì)及合成均由Invitrogen Biotechnology Co，LTD 中 國公司合 成，PLA2mRNA 上游引物序列：5′－AAACCGCCTTCCACTACGCT－3′，下游引物序列：5′－CATCTCCTGCTTGCCCATCT－3′，Action 上 游 引 物 序 列：5′－CGAGATCGTGCGGGACAT－3′，下游引物序列：5′－CAGGAAGGAGGGCTGGAAC－3′，PLA2mRNA基因表達(dá)計(jì)算方法采用2－△△CT方法進(jìn)行半定量分析。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)（ˉx±s）標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析。當(dāng)P＜0．05說明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．HE染色觀察

光鏡下觀察，正常組肌纖維排列整齊，且大小一致（見圖1A）。損傷組，肌纖維大量斷裂、崩解，部分萎縮，肌纖維明顯萎縮、扭曲、壞死，間隙明顯增大，炎癥反應(yīng)明顯（見圖1B）。損傷后第5d組兩組肌纖維萎縮、壞死均明顯減輕，自然恢復(fù)組與按摩組相比炎癥反應(yīng)仍較明顯，且肌纖維間隙較大、排列紊亂，可見明顯結(jié)締組織填充，而按摩組新生的肌纖維明顯較自然恢復(fù)組多，且排列緊密（見圖1C、D）。損傷后第10d，按摩組肌纖維排列更緊密整齊，肌纖維間見少量結(jié)締組織填充，同健康組逐漸接近，而損傷后第10d自然恢復(fù)組，肌纖維排列仍較紊亂，結(jié)締組織同肌纖維交織，顏色呈蒼白色，肌纖維之間仍有結(jié)締組織填充（見圖1E、F）。

2．GSH－Px活力值

表1示，正常對照組（A）活力值為55．5429，傷后第3d（B）大幅度升高；經(jīng)按摩干預(yù)，傷后第5d時(shí)，按摩組（C）GSH－Px水平較自然恢復(fù)組（D）顯著減少（P＜0．01）；傷后第10d，同樣出現(xiàn)按摩組（C）的GSH－Px表達(dá)水平顯著低于自然恢復(fù)組（D）（P＜0．05），提示按摩促進(jìn)損傷的修復(fù)。通過折線圖（圖2）可觀察到，正常兔GSH－Px處于較低水平，損傷后迅速升高，傷后第3d顯著增高，而后開始下降，而經(jīng)過按摩干預(yù)后，在傷后第5d，按摩組GSH－Px水平較自然恢復(fù)組偏低（P＜0．01），在下降過程中，按摩組較自然恢復(fù)組下降明顯，且具有顯著性差異（P＜0．01）。

3．MPO活力值

表1示，正常對照組（A）活力值為195．1150，傷后第3d（B）大幅度升高；經(jīng)按摩干預(yù)，傷后第5d時(shí)，按摩組（C）MPO表達(dá)水平較自然恢復(fù)組（D）明顯減少（P＜0．01）；傷后第10d，按摩組（C）MPO水平顯著低于自然恢復(fù)組（D）（P＜0．01）。通過折線圖（圖2）觀察，正常兔MPO處于較低水平，損傷后迅速升高，傷后第3d顯著增高，而后開始下降，而經(jīng)過按摩干預(yù)后，在傷后第5d，按摩組MPO水平較自然恢復(fù)組偏低（P＜0．01），在下降過程中，按摩組較自然恢復(fù)組下降明顯，且差異具有顯著性（P＜0．01）。

表1 損傷后GSH－Px和MPO的活力變化情況（±s）Table 1 Effect of massage on the value of GSH－Px and MPO＇s activities in each group（±s）

表1 損傷后GSH－Px和MPO的活力變化情況（±s）Table 1 Effect of massage on the value of GSH－Px and MPO＇s activities in each group（±s）

＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，與同時(shí)間段的自然恢復(fù)組比較；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，與正常對照組（A）比較。＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，the massage group（C）was compared with the natural restoration group（D）in the same time slot；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，every group was compared with the normal group（A）．

groups Normal（A） Injure（B） the 5th day after injury Massage（C） Natural restoration（D）the 10th day after injury Massage（C） Natural restoration（D）GSH－Px 55．5429±14．6182 136．1833±18．9154＃＃93．9429±22．4785＊＊＃＃117．9429±18．7348＃＃68．5714±20．2318＊＃94．4857±15．7812＃＃MPO 195．1150±34．4581 360．2419±26．0723＃＃265．4867±15．4892＊＊＃＃331．8584±20．1084＃＃219．4896±25．9215＊＊＃294．9852±17．0487＃＃

4．PLA2mRNA的表達(dá)

如表2示，按摩組和自然恢復(fù)組同正常對照組相比PLA2mRNA具有明顯表達(dá)（P＜0．05）；經(jīng)按摩干預(yù)，傷后第5d，PLA2mRNA的表達(dá)水平自然恢復(fù)組（D）是按摩組（C）的1．45倍（P＜0．01）；傷后第10d，PLA2mRNA的表達(dá)水平自然恢復(fù)組（D）是按摩組（C）的1．32倍（P＜0．05）。各組PLA2的擴(kuò)增曲線和溶解曲線顯示如圖3。

圖1 各組股四頭肌組織學(xué)觀察（HE×200）A：正常對照組組；B：損傷組；C：損傷第5d按摩組；D：損傷第5d自然恢復(fù)組；E：損傷第10d按摩組；F：損傷第10d自然恢復(fù)組。Fig．1Effect of massage on histological observations of each group of quadriceps（HE × 200）A：The normal group；B：The injury group；C：The massage group on the 5th day after injury；D：The Natural recovery group on the 5th day after injury；E：The massage group on the 10th day after injury；D：The Natural recovery group on the 10th day after injury．

圖2 GSH－Px和MPO活力值變化情況Fig．2Effect of massage on the value of GSH－Px and MPO＇s activities in each group

圖3 A：目的基因PLA2擴(kuò)增曲線；B：目的基因PLA2溶解曲線；C：各組兔骨骼肌PLA2mRNA相對表達(dá)量比較Fig．3A：The amplification curve of PLA2；B：The solubility curve of PLA2；C：Effect of massage on PLA2mRNA expression in skeletal muscle of each group of rabbits

討 論

自由基的產(chǎn)生會危害生物體。自由基損傷血管內(nèi)皮的機(jī)理可能是增加血管壁的通透性，導(dǎo)致組織水腫，運(yùn)動內(nèi)源性自由基生成增加及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增加可以導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)的變化，損傷膜的完整性，使膜通透性增加，Ca2＋外流。作為炎癥反應(yīng)的一部分，聚集的顆粒細(xì)胞又可釋放出更多的自由基。因此，損傷修復(fù)過程中盡快消除自由基已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。

自由基的實(shí)驗(yàn)研究很多，多是從力竭離心運(yùn)動［4－5］和缺血再灌注［6－7］等方面進(jìn)行研究及治療。而臨床上急性骨骼肌損傷很常見，但研究較少，本實(shí)驗(yàn)則是采用重物打擊法急性損傷造模，施以按摩治療的方法進(jìn)行研究。急性骨骼肌鈍挫傷會使受損肌肉局部產(chǎn)生大量自由基，及中性粒細(xì)胞浸潤［8］。自由基和骨骼肌損傷的關(guān)聯(lián)不是單方面的。自由基損傷會影響骨骼肌挫傷的病理?？赡軝C(jī)制包括：（1）損傷局部缺血、缺氧，引起肌細(xì)胞代謝紊亂。（2）局部滲出物和應(yīng)激產(chǎn)物的自動氧化。（3）某些金屬離子的釋放［9］。

GSH－Px是廣泛存在于生物體內(nèi)的抗氧化酶，機(jī)體抗氧化酶活性的增加、抗氧化能力的提高［10］，可以加快對體內(nèi)自由基的清除。自由基攻擊細(xì)胞的嚴(yán)重程度，間接反映過氧化的程度，GSH－Px的變化可反映骨骼肌的抗氧化能力。GSH－Px是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中的一個(gè)重要的酶，可清除脂質(zhì)過氧化物和H2O2等氧自由基和有機(jī)過氧化物，使體內(nèi)的過量超氧離子維持在一定水平，從而減少對機(jī)體的氧化損傷。起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性的作用［11－12］。而MPO是中性粒細(xì)胞的功能激活標(biāo)志，反映中性粒細(xì)胞黏附與聚集。許多研究顯示，MPO不僅能殺滅吞噬于細(xì)胞內(nèi)的微生物，而且對機(jī)體產(chǎn)生和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等多方面發(fā)揮作用，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的許多過程［13］。MPO缺陷的中性粒細(xì)胞因過量的注入炎癥部位而發(fā)生氧化反應(yīng)，大量的超氧化物和氧化物形成，造成炎癥部位組織細(xì)胞損傷。此外，MPO能保證髓系細(xì)胞的正常分化成熟及功能，其機(jī)制是與DNA牢固結(jié)合形成復(fù)合物，有效保護(hù)DNA防止其在氧化過程中受損，對肌肉損傷有一定保護(hù)的作用［14］。本實(shí)驗(yàn)中，損傷后第3天時(shí)，為保護(hù)肌細(xì)胞的完整性，GSH－Px和 MPO活力值都較正常組大幅度增加，正是因?yàn)榇藭r(shí)自由基增加，大量中性粒細(xì)胞浸潤以應(yīng)對氧化反應(yīng)；而經(jīng)按摩治療后，在損傷后第5天和第10天，兩者的活力值在按摩組都明顯低于自然恢復(fù)組（P＜0．05or P＜0．01），間接說明了同時(shí)間段，按摩能夠加快自由基的清除，使得中性粒細(xì)胞浸潤減少，減輕炎癥反應(yīng)，利于肌細(xì)胞的修復(fù)。

同樣的，PLA2是一類具有廣泛生理、病理效應(yīng)的生物酶［15－16］，也是一個(gè)非常重要的炎性介質(zhì)，主要作用于富含磷脂的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，能夠分解膜上的卵磷脂而生成溶血性卵磷脂和游離脂肪酸（其中主要是花生四烯酸），后兩者又可在酶的作用下產(chǎn)生多種重要的炎性介質(zhì)，從而對組織細(xì)胞產(chǎn)生損害作用。然而自由基的存在，可使線粒體脂質(zhì)雙層發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，同時(shí)，自由基可以激活PLA2，使PLA2的活性增加，膜磷脂降解的速度增快。PLA2的活性增加可使膜磷脂降解產(chǎn)物溶血磷脂、白三烯、前列腺素等物質(zhì)生成增多，這些物質(zhì)可以促進(jìn)細(xì)胞膜及亞細(xì)胞膜的降解反應(yīng)，使膜的剛性增加，膜的滲透性轉(zhuǎn)運(yùn)增加［17］，這樣會使炎癥反應(yīng)擴(kuò)大，正如實(shí)驗(yàn)中損傷后第3天結(jié)果所顯示。在損傷后PLA2活性增加的原因主要和自由基、脂質(zhì)過氧化物及鈣濃度有關(guān)，當(dāng)線粒體自由基生成增加、鈣積聚和膜脂質(zhì)過氧化水平升高時(shí)，PLA2就會被激活。PLA2以及溶血磷脂和自由脂肪酸還能直接破壞細(xì)胞膜并引起水腫，PLA2還可興奮傷害感受器，使疼痛感產(chǎn)生［18］。在損傷修復(fù)階段，通過按摩治療，同自然恢復(fù)組比較可見按摩組PLA2表達(dá)明顯減少（P＜0．05or P＜0．01），更好地保護(hù)了肌細(xì)胞膜，利于減輕水腫及疼痛感。這些和我們的前期，按摩能減少骨骼肌損傷過程中PGE2、CRP［19］，利于損傷修復(fù)結(jié)果相符。

綜上所述，按摩能夠?qū)趋兰⊥饬p傷恢復(fù)起到積極作用。骨骼肌挫傷后的修復(fù)與再生機(jī)制較復(fù)雜，自由基反應(yīng)僅僅是一方面。因此，按摩對與骨骼肌損傷修復(fù)的詳細(xì)機(jī)制和其他因素的研究對于我們?nèi)允且粋€(gè)重要課題。

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