朱力杰，孟憲軍*，李 斌，劉秀英，陶冬冰

（沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

高速逆流色譜分離制備北五味子中科羅索酸

朱力杰，孟憲軍*，李 斌，劉秀英，陶冬冰

（沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

建立通過高速逆流色譜從北五味子中快速分離科羅索酸的方法。將北五味子的乙醇提取物經(jīng)AB-8大孔樹脂初步純化后直接采用高速逆流色譜進行分離，并通過高效液相色譜法考察了粗提物在不同溶劑體系中的分配情況。結果表明，最佳溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶5∶5∶4，V/V），從150 mg粗提物中一次性分離制備得到6.3 mg純度為97.6%的科羅索酸。該方法分離效率較高，對科羅索酸在食品醫(yī)藥領域的應用具有重要意義。

高速逆流色譜；科羅索酸；北五味子

北五味子（Schisandra chinensis （Turcz.） Baill）為木蘭科五味子屬植物，主要分布于東北亞地區(qū)[1]，在我國以遼寧省出產的質量為最佳，亦有“遼五味”之稱[2]。其果實和藤莖作為傳統(tǒng)的藥材和功能性食品，具有保肝、鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛、保護腦神經(jīng)細胞、抗衰老、增強免疫、抗腫瘤等多種功效[3]。目前對北五味子化學成分的研究主要集中在木質素[4]、多糖[5]和有機酸[6]類化合物上，對于其三萜類化合物的報道較少且以低純度提取工藝研究為主。研究發(fā)現(xiàn)，北五味子中的三萜類成分——科羅索酸具有很強的生物活性，包括降血糖[7]、抑制癌細胞增殖[8]、誘導癌細胞凋亡[9]、保護細胞損傷[10]等，其結構如圖1所示?？屏_索酸已進入美國食品和藥物管理局的Ⅲ期臨床藥效學評價[11]，作為食品補充劑已在國外得到認可[12]，在食品、保健品等工業(yè)中具有較好的發(fā)展前景[13]。目前，科羅索酸的分離制備往往采用反復柱層析[14]等手段，缺乏快速、簡便的方法，限制了其應用。

圖1 科羅索酸的化學結構Fig.1 Chemical structure of corosolic acid

高速逆流色譜（high speed counter current chromatography，HSCCC）是Ito等[15]發(fā)明的一種新型的液-液分配色譜，與常規(guī)固-液色譜分離方法相比較，由于采用液體作為固定相載體，目標化合物在互不相容的兩相由于分配系數(shù)的不同而得以分離，解決了傳統(tǒng)固體載體樣品死吸附、變性、峰形拖尾等問題[16]，在食品、醫(yī)藥、天然產物等領域有著廣泛應用[17-23]。本實驗在課題組前期研究[24]的基礎上，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，準確、快速地測定了北五味子藤莖中的科羅索酸在兩相溶劑體系中的分配系數(shù)，從而選定了HSCCC的溶劑體系，制備了高純度的科羅索酸。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北五味子藤莖（2012年產） 撫順青松藥業(yè)有限公司；AB-8大孔樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；無水乙醇、正己烷、乙酸乙酯、甲醇等均為分析純；HPLC分析用的乙腈等均為色譜純。

1.2 儀器與設備

TBE300B型高速逆流色譜 上海同田生物技術有限公司；HPLC系統(tǒng)（配有1525型溶劑泵系統(tǒng)、2487型紫外-可見光檢測器） 美國Waters公司；AM-500MHz型核磁共振譜儀 瑞士Bruker公司；IKA-MS1型旋渦混合儀 德國IKA公司；搖擺式高速中藥粉碎機 浙江溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠；DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 北五味子粗提物的制備

1.3.2 HPLC分析條件

分析色譜柱：Hypersil ODS-2 C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；溫度：25 ℃；樣品質量濃度：3 mg樣品溶于1 mL甲醇；進樣體積：15 μL；流動相流速：1 mL/min；流動相：A：水，B：乙腈；檢測器：紫外-可見光檢測器（200～800 nm，210 nm為檢測波長）；HPLC梯度洗脫程序為0～20 min，35%～90% B； 20～25 min；90%～95% B；25～30 min，95% B。

1.3.3 分配系數(shù)（K）的測定

稱取5 mg粗提物粉末，分別溶于不同體積比的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系中，采用1.3.2節(jié)中的HPLC分析方法，取各體系上、下兩相各15 μL，分別進樣檢測，記錄各樣品的峰面積。樣品在不同溶劑體系中的分配系數(shù)按式（1）計算。

式中：K為分配系數(shù)；cU為上相中的濃度/（mol/L）；cL為下相中的濃度/（mol/L）；AU為上相峰面積/（mAU·s）；AL為下相峰面積/（mAU·s）。

1.3.4 樣品的HSCCC分離

將正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶5∶5∶4，V/V）溶劑體系置于分液漏斗中，搖勻，靜置過夜，取上相為固定相，下相為流動相，經(jīng)超聲波脫氣后，用5 mL流動相完全溶解樣品。開機打開工作站，預熱后，以20 mL/min的速度將固定相泵入HSCCC的螺旋柱中。待有固定相流出后，將主機設置為正轉（順時針），轉速緩慢調至800 r/min，同時將流動相以5 mL/min的速率泵入。至固定相不再流出時，說明溶劑系統(tǒng)已經(jīng)達到平衡，將流速降至2 mL/min，平衡基線。用流動相清洗樣品環(huán)后，將溶解好的樣品經(jīng)由進樣閥注入樣品環(huán)中，同時開始采集數(shù)據(jù)，檢測波長為210 nm，按照色譜峰對目標成分進行收集。

隨著我國土地流轉的加劇和農業(yè)現(xiàn)代化、規(guī)?；陌l(fā)展，傳統(tǒng)農資行業(yè)銷售渠道正面臨著翻天覆地的改變，廠家渠道貼地下沉，市場競爭不斷加劇，新型農業(yè)經(jīng)營主體和新型服務平臺的層出不窮，農資企業(yè)在業(yè)務拓展上受到越來越多的阻力和挑戰(zhàn)。如何在新的農業(yè)發(fā)展形勢下?lián)肀ё兓⒈P活市場成為肥料生產企業(yè)亟待破解的難題。

1.3.5 純度分析及結構鑒定

采用1.3.2節(jié)的HPLC分析方法，根據(jù)峰面積歸一化法對制備得到的樣品進行純度分析。HSCCC分離得到的樣品經(jīng)核磁共振氫譜（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）和核磁共振碳譜（13C-NMR）鑒定，核磁共振過程中溶劑為氘代吡啶（C5D5N），以四甲基硅烷為內標物。

2 結果與分析

2.1 HSCCC溶劑體系的選擇

表1 不同體積比的溶劑體系下北五味子粗提物的分配系數(shù)Table1 Partitioning coefficients ((K) of the crude extract of Schisannddrraa chineennssiiss (Turcz.) Baill in solvent systems with different volume ratios

選擇合適的溶劑體系是能否成功應用HSCCC對目標物進行分離的關鍵。根據(jù)相關原理，通常目標物在溶劑體系中的分配系數(shù)在0.5～2之間能達到滿意的分離效果。本實驗目標產物存在于70%的乙醇洗脫部位，故選用中等偏弱極性的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系。樣品在該溶劑體系中的分配系數(shù)見表1。體積比為5∶5∶5∶5時，樣品的分配系數(shù)較小，主要溶解于下相中；其余3個體積比的溶劑體系的分配系數(shù)均在可分離范圍內。故按照1.3.4節(jié)的方法，分別進樣考察分離效果，HSCCC色譜圖見圖2。

圖2 北五味子粗提物在不同溶劑體系下的HSCCC色譜圖Fig.2 HSCCC chromatograms of the crude extract of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill in different solvent systems: (a) n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (5∶5∶5∶6, V/V), (b) n-hexane-ethyl acetatemethanol-water (6∶5∶5∶5, V/V), and (c) n-hexane-ethyl acetate-methanolwater (6∶5∶5∶4, V/V)

由圖2可知，根據(jù)HSCCC圖譜比較，在體積比為5∶5∶5∶6時，組分1與其他雜質沒有分開，且出峰時間較為延后；在體積比為6∶5∶5∶5時，組分1與雜質基本分開，出峰時間有一定提前；在體積比為6∶5∶5∶4時，組分1的分離度和出峰時間均較為適宜。故最終確定溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶5∶5∶4，V/V）。

2.2 目標物的HSCCC分離

在溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶5∶5∶4，V/V）條件下，按照1.3.4節(jié)的方法進行分離。將150 mg樣品用5 mL流動相完全溶解樣品后進樣。根據(jù)HSCCC色譜圖收集并鑒定各組分，將組分1按純度合并，重結晶后得到6.3 mg。

2.3 樣品的純度分析

按照1.3.5節(jié)的方法，采用HPLC法對2.2節(jié)中分離得到的組分1進行純度分析，色譜圖見圖3，利用峰面積歸一化法得到組分1的純度為97.6%。

圖3 北五味子粗提物（a）、HSCCC分離得到的組分1（b）的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of the crude extract of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill (a) and component 1 from the crude extract (b) by HSCCC

2.4 樣品的結構鑒定

HSCCC分離得到的組分1在吡啶中為白色針狀結晶。通過核磁共振鑒定，其波譜數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（300 MHz，C5D5N，圖4）：d 5.48 （1H, t, J=3.0 Hz），3.41（1H, d, J＝9.0 Hz），2.63（1H, d, J＝11.4 Hz）；1.29, 1.22, 1.09, 1.06, 1.05, 1.03, 1.01 （each 3H, s）。13C-NMR（75 MHz，C5D5N，圖5）：48.0（C-1）, 68.6（C-2），83.8（C-3），40.0（C-4），55.9（C-5），18.9（C-6），33.5（C-7），39.9（C-8），48.1（C-9），38.5（C-10），23.8（C-11），125.6（C-12），139.3（C-13），42.6（C-14），28.7（C-15），24.9（C-16），48.0（C-17），53.5（C-18），39.4（C-19），39.4（C-20），31.1（C-21），37.5（C-22），29.4（C-23），17.7（C-24），17.0（C-25），17.5（C-26），23.9（C-27），179.9（C-28），21.4（C-29），17.5（C-30）。與文獻[25]對照，將該化合物鑒定為科羅索酸。

圖4 組分1的11H-NMR圖-NMRFig.4 1H-NMR spectrum of component 1

圖5 樣品11號的1133C--NNMMRR圖Fig.5 13C-NMR spectrum of component 1

3 結 論

本研究采用HSCCC，通過正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶5∶5∶4，V/V）溶劑體系從北五味子粗提物中分離得到了科羅索酸。一次進樣150 mg粗提物后可以分離出6.3 mg科羅索酸，純度達97.6%。采用HSCCC對北五味子中科羅索酸的分離目前還未見文獻報道，本研究對于拓展北五味子中科羅索酸的在食品、醫(yī)藥等領域的應用前景具有重要意義。

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Preparative Isolation and Purification of Corosolic Acid from Schisandra chinensis (Turcz.) Baill by High Speed Counter Current Chromatography

ZHU Li-jie, MENG Xian-jun*, LI Bin, LIU Xiu-ying, TAO Dong-bing
(College of Food, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

An effective and rapid method for the separation of corosolic acid from Schisandra chinensis (S. chinensis) (Turcz.) Baill by high-speed counter-current chromatography (HSCCC) was established. The alcohol extract of S. chinensis (Turcz.) Baill was initially separated using AB-8 macroporous resins and further purified by HSCCC. A high performance liquid chromatography (HPLC) method was used to determine the partitioning coefficient of crude extract in different solvent systems. The results showed a solvent system consisting of n-hexane, ethyl acetate, methanol and water (6:5:5:4, V/V) was the best one for the HSCCC separation. A total of 6.3 mg of corosolic acid with a purity as high as 97.6% was obtained in one step separation from 150 mg of crude extract. The method is of high separation efficiency, and has a great importance for applications of corosolic acid in the food and medical fields.

high-speed counter-current chromatography; corosolic acid; Schisandra chinensis (Turcz.) Baill

TS201.3

A

1002-6630（2014）02-0001-04

10.7506/spkx1002-6630-201402001

2013-05-22

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201325）；遼寧省教育廳科學研究一般項目（L2011109）

朱力杰（1986—），男，博士研究生，研究方向為功能性食品。E-mail：charleswestwood@163.com

*通信作者：孟憲軍（1960—），男，教授，博士，研究方向為果蔬加工與功能性食品。E-mail：mengxjsy@126.com