陳 晨，胡文忠*，田沛源，姜愛麗

（大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，生物化學(xué)工程國家民委-教育部重點實驗室，遼寧省食源性病原微生物快速檢測與控制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600）

超聲輔助提取香蕉皮多酚工藝優(yōu)化及其抗氧化性的分析

陳 晨，胡文忠*，田沛源，姜愛麗

（大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，生物化學(xué)工程國家民委-教育部重點實驗室，遼寧省食源性病原微生物快速檢測與控制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600）

采用超聲輔助技術(shù)從香蕉皮中提取多酚類物質(zhì)，利用響應(yīng)曲面法建立多酚提取率與液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時間之間的數(shù)學(xué)模型，確定香蕉皮多酚的適宜提取工藝參數(shù)；通過體外實驗評價香蕉皮多酚的抗氧化能力。結(jié)果表明：多酚提取率模型擬合度良好，超聲輔助提取香蕉皮多酚的適宜工藝參數(shù)為液料比9∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)54%、超聲溫度53 ℃、超聲時間43 min，在此條件下多酚提取率為2.931%，提取的香蕉皮多酚具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的能力，半抑制質(zhì)量濃度分別為0.422 8、0.255 2 mg/mL和0.243 9 mg/mL。

香蕉皮；多酚；超聲輔助提??；響應(yīng)曲面；抗氧化

香蕉皮是香蕉加工產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物，約占香蕉全果質(zhì)量的30%，2011年我國香蕉種植面積超過36.67萬公頃，產(chǎn)量約為950萬t[1]，意味著2011年我國約產(chǎn)生了300萬t的香蕉皮，而目前香蕉皮除少數(shù)做動物飼料應(yīng)用外，大多被廢棄。香蕉皮中主要含有多酚、果膠、纖維素、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)和糖類，還有多種維生素和無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分[2-3]。多酚是廣泛存在于植物體內(nèi)的一類多元酚類化合物，大量研究[4-6]結(jié)果表明，多酚具有抗癌、抗菌、抗氧化和預(yù)防心腦血管疾病等多種生物活性。以香蕉皮為原料提取多酚，不僅能減輕環(huán)境污染，還可以創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益。

超聲輔助提取是一項新型的天然產(chǎn)物輔助溶劑提取技術(shù)，超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)、機(jī)械作用和空化效應(yīng)可以使原料細(xì)胞壁快速破碎，促進(jìn)提取劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與目標(biāo)提取成分充分混合，加速胞內(nèi)物質(zhì)溶出、擴(kuò)散和釋放，有助于提取效率的提高[7-9]。超聲波技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物多酚物質(zhì)的提取[10-13]。本實驗通過超聲輔助提取香蕉皮多酚，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化香蕉皮多酚的適宜提取工藝，并通過體外實驗探討了香蕉皮多酚的抗氧化活性，目的是進(jìn)一步挖掘香蕉皮的可利用程度，為開發(fā)香蕉皮多酚抗氧化類產(chǎn)品提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香蕉皮：菲律賓產(chǎn)成熟鮮香蕉，購于大連新瑪特超市，取皮用于實驗。

沒食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris） 美國Sigma公司；福林試劑、碳酸鈉、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、乙醇、鹽酸、碳酸鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；OKS-型電熱恒溫水浴鍋 上海中新醫(yī)療儀器有限公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；UV-2550型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；X-30R超速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司；LD85箱式冷凍干燥儀 美國Millrock科技公司。

1.3 方法

1.3.1 香蕉皮多酚的提取

準(zhǔn)確稱取一定量香蕉皮，切片、沸水中熱燙5 min以鈍化多酚氧化酶的活性。冷卻后破碎均質(zhì)轉(zhuǎn)移到100 mL絲扣瓶中，加入浸提劑（乙醇溶液）。放入功率200 W頻率40 kHz超聲清洗器或50 ℃水浴鍋中，在不同的條件下浸提香蕉皮多酚。浸提后，用冷凍高速離心機(jī)對萃取液以低溫（控制在5 ℃以下）10 000 r/min離心15 min。取上清液于40 ℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，所得濃縮液真空冷凍干燥，得香蕉皮多酚提取物，用于抗氧化活性的測定。

1.3.2 多酚含量的測定

采用福林酚法[14]進(jìn)行測定。吸取1 mL香蕉皮多酚提取液（適當(dāng)?shù)南♂專?，加入福林試?.2 mL，混勻，在0.5～8 min內(nèi)加入1 mL 20%的Na2CO3溶液，充分混合，30 ℃避光放置0.5 h后，在波長760 nm處測吸光度。以沒食子酸為標(biāo)樣，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.442 4x＋0.002 3（R2=0.999 8）。多酚提取率（以干質(zhì)量計）按公式（1）計算：

1.3.3 香蕉皮多酚提取工藝優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗

分別考察液料比（5∶1、7∶1、10∶1、12∶1、15∶1、18∶1，mL/g）、超聲溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%、80%）和超聲時間（20、30、40、50、60、70 min）對香蕉皮多酚提取率的影響。

1.3.3.2 響應(yīng)曲面試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以X1（液料比）、X2（乙醇體積分?jǐn)?shù)）、X3（超聲溫度）、X4（超聲時間）為自變量，以香蕉皮多酚提取率Y為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗。試驗因素和水平的取值見表1。對響應(yīng)面試驗結(jié)果所得數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.05軟件進(jìn)行分析和作圖。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素水平編碼表Table1 Codes and levels of factors for RSM experiments

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

根據(jù)Monica等[15]的方法稍作修改。取樣品溶液2.00 mL，加入2.00 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混勻，避光放置30 min，在517 nm波長處測定吸光度At；同法取2.00 mL蒸餾水加入2.00 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液混勻，測定吸光度A0；取2.00 mL待測樣品加入2.00 mL乙醇混勻，測定吸光度Ab。DPPH自由基清除能力可用公式（2）表示：

1.3.5 羥自由基清除能力的測定

采用水楊酸法[16]測定。取2 mL樣品于具塞試管中，依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4、2 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、2 mL 6 mmol/L H2O2溶液，在37 ℃反應(yīng)30 min后，在波長510 nm處測定吸光度AX，未加入H2O2的溶液的吸光度AX0，按相同方法測定未加入樣品的溶液吸光度A0，均以蒸餾水為參比溶液。羥自由基清除能力可用公式（3）表示：

1.3.6 超氧陰離子自由基清除能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法[17]測定。將待測樣品溶液1.0 mL加入1.8 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.2），空白組加入同體積蒸餾水，于25 ℃保溫10 min，再加入100 ?L 25 ℃預(yù)熱的0.01 mol/L鄰苯三酚溶液，（空白以等量10 mmol/L的HCl溶液代替），迅速搖勻，在320 nm波長處，每隔0.5 min測定1次吸光度，線性時間為4 min，吸光度的斜率表示鄰苯三酚自氧化速率，鄰苯三酚自氧化速率記為’A0，加入香蕉皮多酚后鄰苯三酚氧化速率記為’A1。超氧陰離子自由基清除能力可用公式（4）表示：

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉皮多酚提取率的比較

首先比較未使用超聲波與使用超聲波輔助提取香蕉皮多酚的提取率。在相同的實驗條件下（液料比10∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲溫度50 ℃、超聲時間30 min），超聲輔助提取香蕉皮多酚的提取率為2.681%，顯著高于未使用超聲輔助的多酚提取率1.206%（P＜0.05），說明超聲輔助有助于香蕉皮多酚的提取。馬亞琴等[18]利用100 kHz的超聲波輔助提取溫州蜜柑皮中的多酚類物質(zhì)，結(jié)果表明超聲輔助提取能顯著提高總酚的提取率并增強(qiáng)抗氧化能力。D’Alessandro等[12]研究表明采用超聲輔助能使黑果腺肋花楸多酚的提取率增加85%。

2.2 香蕉皮多酚提取的單因素試驗

圖1 液料比（a）、超聲溫度（b）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（c）和超聲時間（d）對香蕉皮多酚提取率的影響Fig.1 Effects of liquid-to-material ratio, ultrasonic temperature, ethanol concentration, ultrasonic radiation time on polyphenol yield

在超聲溫度50 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲溫度30 min的條件下，研究液料比對香蕉皮多酚提取率的影響。結(jié)果如圖1a所示，隨著液料比增大，多酚提取率逐漸上升，當(dāng)達(dá)到10∶1后提取率開始緩慢下降，說明多酚的溶出量已達(dá)飽和，從節(jié)約溶劑的角度考慮，液料比的考察范圍定為12∶1～8∶1。

圖1b顯示了在液料比10∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲時間30 min的條件下，不同超聲溫度對香蕉皮多酚提取率的影響，可以看出香蕉皮多酚的提取率隨著溫度的升高先增大后減小，當(dāng)溫度為50 ℃時提取率最大。一般來說溫度越高越有利于植物多酚物質(zhì)的提取[19]，但隨著溫度升高使能量消耗增大、成本增加，同時較高的溫度使多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞，此外在高溫條件下也會導(dǎo)致乙醇揮發(fā)，使液料比改變，從而影響多酚的提取率[20-21]。

多酚是一類極性范圍很廣的化合物，當(dāng)提取溶劑的極性與多酚的極性接近時，有利于多酚的提取。因此本研究在液料比10∶1、超聲溫度50 ℃、超聲時間30 min的條件下，研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取率的影響。結(jié)果如圖1c所示，香蕉皮多酚的提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而逐漸增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，多酚提取率最大，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)大于60%后，多酚提取率逐漸降低。這主要是因為在植物體內(nèi)多酚一部分以游離的形式存在液泡中，一部分以與蛋白質(zhì)、多糖通過氫鍵或疏水健結(jié)合的形式存在于細(xì)胞壁中，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時，高體積分?jǐn)?shù)的乙醇使蛋白質(zhì)變性，影響與之結(jié)合多酚的溶出，從而導(dǎo)致多酚提取率的下降[22]。

固定液料比10∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲溫度50 ℃，研究超聲時間對香蕉皮多酚提取率的影響。結(jié)果如圖1d所示，隨著超聲時間的延長，超聲波對物料作用更加充分，多酚的溶出量也逐漸增大，40 min時達(dá)到最大量，延長超聲時間使提取率逐漸下降，這可能是因為長時間超聲振動導(dǎo)致多酚結(jié)構(gòu)破壞[11]，此外超聲時間延長也會增加能耗，因此將超聲時間的考察范圍定為30～50 min。

2.3 回歸方程的建立與分析

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗的方案設(shè)計及結(jié)果Table2 Experimental design and results for optimization of extraction parameters by RSM

采用Design-Expert 8.05軟件對表2的響應(yīng)面試驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到試驗條件與響應(yīng)值間的回歸模型：

對回歸模型進(jìn)行方差分析（表3）發(fā)現(xiàn)，得到的回歸模型極顯著，失擬檢驗不顯著，決定系數(shù)（= 0.992 1，模型的擬合程度高，試驗誤差小，說明該回歸模型能較好地描述各因素與響應(yīng)值間的關(guān)系，利用此方程模型確定超聲輔助提取香蕉皮多酚的工藝參數(shù)是可行的。

對回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗可知，X1、X2、X3、X4、X1X3、X2X3、X3X4、X12、X22、X23、X24對多酚的提取率有顯著影響，其他因素影響不顯著。對回歸模型進(jìn)行中心標(biāo)準(zhǔn)化處理，可以直接從回歸系數(shù)絕對值的大小來分析各個因素的變化對多酚提取率的影響，依次為超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間和液料比。

表3 回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance for the fitted regression equation

分別將模型中的2個因素固定在0水平上，得到另外兩個因素交互作用對多酚提取率的子模型，用Design-Expert 8.05軟件的Model Graph程序做響應(yīng)曲面圖，見圖2。

圖2 各因素對香蕉皮多酚提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for the effects of liquid-to-material ratio, ethanol concentration, temperature and ultrasonic radiation time on polyphenol yield

通過觀察圖2中響應(yīng)曲面的變化情況和等高線的疏密程度可知，超聲溫度與液料比、超聲時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對香蕉皮多酚提取率的影響比較強(qiáng)烈，圖2a和圖2e中的響應(yīng)面變化趨勢平緩，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時間、液料比的交互作用對多酚提取率的影響較小。從圖2可以看出，Y值隨著4個因素的變化均為開口向下的拋物線，即隨著4個因素值的單獨增加，多酚提取率的變化趨勢都是先增加后降低的，當(dāng)液料比8.7～9.4（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)52%～57%、超聲溫度51～58 ℃、超聲時間35～44 min的范圍內(nèi)時，多酚提取率保持在較高值。

2.4 適宜條件和回歸模型的驗證

采用Design-Expert 8.05軟件對得到的回歸模型進(jìn)行優(yōu)化處理，得到超聲輔助提取香蕉皮多酚的適宜工藝條件為液料比9∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)54%、超聲溫度53 ℃、超聲時間43 min，預(yù)測香蕉皮多酚的提取率為2.956%，在此條件下，多酚提取率的實驗驗證值為2.931%，驗證值與預(yù)測值誤差在±1%以內(nèi)，說明本研究優(yōu)化得到的提取香蕉皮多酚工藝參數(shù)是可靠的，具有實用價值。

2.5 香蕉皮多酚的抗氧化性分析

自由基是一類含有未配對電子的分子、原子或原子基團(tuán)，正常情況下人體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，然而衰老及一些環(huán)境不利因子會引起體內(nèi)的自由基代謝失衡，導(dǎo)致自由基累積，過量的自由基會給機(jī)體造成不可逆轉(zhuǎn)的氧化損傷，從而加快衰老，誘發(fā)心血管疾病、癌癥、糖尿病等諸多疾病[23]。多酚是一類活性較強(qiáng)的抗氧化物質(zhì)，多酚具有供氫能力因而可有效清除自由基，同時還可與過氧化自由基結(jié)合使其成為穩(wěn)定的化合物，另外多酚還可以通過抑制氧化酶和絡(luò)合金屬離子等起到抗氧化作用[24]。本實驗研究了香蕉皮多酚對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力，測定了香蕉皮多酚對3種自由基的半抑制質(zhì)量濃度（half maximal （50%） inhibitory concentration，IC50）。半抑制質(zhì)量濃度是指清除率為50%時抗氧化劑的質(zhì)量濃度，IC50越小，抗氧化劑清除自由基的能力越強(qiáng)[25]。從表4可以看出，香蕉皮多酚對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基均有一定的清除能力，且對3種自由基的清除能力存在一定的差異。香蕉皮多酚提取物的羥自由基清除能力高于同質(zhì)量濃度的抗壞血酸，而超氧陰離子自由基和DPPH自由基清除率均小于同質(zhì)量濃度的抗壞血酸，這可能與香蕉皮多酚粗提物中主要活性物質(zhì)的純度有關(guān)。今后仍需進(jìn)一步測定香蕉皮多酚種類和含量，并對香蕉皮多酚粗提取物中的主要活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化。

表4 香蕉皮多酚和抗壞血酸對3種自由基的半抑制質(zhì)量濃度Table4 IC50 values of banana peel polyphenols and ascorbic acidagainst three free radicals

3 結(jié) 論

在相同的提取條件下，使用超聲波輔助提取香蕉皮多酚的提取率（2.681%）顯著高于未使用超聲技術(shù)提取多酚的提取率（1.206%）。超聲輔助提取香蕉皮多酚的提取條件優(yōu)化數(shù)學(xué)回歸模型是：超聲輔助提取香蕉皮多酚的適宜工藝條件為液料比9∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)54%、超聲溫度53 ℃、超聲時間43 min，在此條件下多酚提取率為2.931%。香蕉皮多酚具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的能力，IC50分別為0.422 8、0.255 2 mg/mL和0.243 9 mg/mL。

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Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Polyphenols from Banana Peel and Their Antioxidant Capacity

CHEN Chen, HU Wen-zhong*, TIAN Pei-yuan, JIANG Ai-li
(Research Center of Engineering and Technology for Rapid Detection of Foodborne Microorganisms and Control, Key Laboratory of Biochemical Engineering, The State Ethnic Affairs Commission, Ministry of Education, College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China)

Response surface methodology (RSM) was employed to optimize liquid-to-material ratio, ethanol concentration, ultrasound radiation time and temperature to obtain a high yield of polyphenols from banana peel by an ultrasonic-assisted extraction technique. The antioxidant activities of polyphenols extracted from banana peel were evaluated by in vitro assays. The results showed that the RSM model developed was able to describe the relationship between the factors (extraction parameters) and the response variable (polyphenol yield). The optimized conditions were determined as follows: solventto-solid ratio, 9:1 (mL/g); ethanol concentration, 54%; temperature, 53 ℃; and ultrasound radiation time, 43 min. Under these conditions, the polyphenol yield obtained was 2.931%. The resulting extract exhibited significant 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), superoxide anion and hydroxyl radical scavenging activities, and the concentrations for 50% inhibition (IC50) were 0.422 8, 0.255 2 and 0.243 9 mg/mL, respectively.

banana peel; polyphenol; ultrasound assisted extraction; response surface methodology; antioxidant activity

TS201.1

A

1002-6630（2014）02-0012-06

10.7506/spkx1002-6630-201402003

2013-01-10

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD38B05）；國家自然科學(xué)基金面上項目（31172009）；大連市科技計劃項目（2012E13SF106）；大連民族學(xué)院博士啟動基金項目（0701-110014）

陳晨（1986—），女，講師，博士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：chenchen@dlnu.edu.cn

*通信作者：胡文忠（1959—），男，教授，博士，研究方向為采后生物學(xué)與技術(shù)。E-mail：hwz@dlnu.edu.cn