蔡 聰，姜 婷，鄭兆娟，歐陽嘉,*

（1.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210037）

等離子體誘變凝結(jié)芽孢桿菌提高木糖利用能力高產(chǎn)L-乳酸

蔡 聰1,2，姜 婷2，鄭兆娟2，歐陽嘉1,2,*

（1.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210037）

為進(jìn)一步提高凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵木糖生產(chǎn)L-乳酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，以實(shí)驗(yàn)室保存的一株能利用木糖產(chǎn)L-乳酸的野生型凝結(jié)芽孢桿菌菌株NL01為出發(fā)菌株，通過等離子體誘變育種技術(shù)和平板菌落初篩、搖瓶復(fù)篩，最終得到一株木糖耐受力強(qiáng)、L-乳酸產(chǎn)量高、遺傳特性穩(wěn) 定的正向突變菌株NL-CC-17。該突變菌株是目前已報(bào)道的木糖耐受力最高的菌株。當(dāng)以100 g/L的木糖為底物，50℃發(fā)酵72 h后，L-乳酸產(chǎn)量達(dá)到82.30 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為92.37%，L-乳酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高21.51%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了16.00%。通過初步優(yōu)化發(fā)酵條件，確定該菌株最佳發(fā)酵溫度為50℃，實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)最佳發(fā)酵pH值為5.5。

常溫常壓等離子體；凝結(jié)芽孢桿菌；誘變；L-乳酸；木糖

乳酸是一種廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)的多用途有機(jī)酸[1-3]。目前，乳酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝主要采用以淀粉質(zhì)原料為底物發(fā)酵生產(chǎn)，這不僅消耗了糧食資源，而且提高了乳酸生產(chǎn)成本[4]。目前，利用豐富且廉價(jià)的木質(zhì)纖維素資源生產(chǎn)乳酸已成為國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)[5-6]。木質(zhì)纖維素經(jīng)過高溫酸解以及酶解處理，可以轉(zhuǎn)變成以木糖和葡萄糖為 主的混合糖液。對(duì)于以葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的過程已有大量報(bào)道[7-9]，而有關(guān)發(fā)酵木糖生產(chǎn)L-乳酸的報(bào)道相對(duì)較少。Taniguchi等[10]利用Enterococcus casseliflavus以木糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，產(chǎn)量為38 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率76%；Ilmén等[11]在重組樹干畢赤酵母菌中表達(dá)乳酸菌的L-乳酸脫氫酶，構(gòu)建的基因工程菌可利用100 g/L木糖生產(chǎn)58 g/L乳酸，糖乳酸轉(zhuǎn)化率為53%；楊英歌等[12]通過氮離子注入方法選育出一株米根霉利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸產(chǎn)量為74.37 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率約74.37%，糖酸轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低?？傮w來說，木糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸研究發(fā)展至今仍然存在糖耐受濃度低、乳酸產(chǎn)量低、糖酸轉(zhuǎn)化率低等問題，不利于生物質(zhì)資源的全利用[13]。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變是清華大學(xué)自主研發(fā)的一種新型誘變育種技術(shù)。與常規(guī)誘變技術(shù)相比，ARTP具有射流溫度低、產(chǎn)生的等離子體均勻、無需真空裝置、操作簡(jiǎn)單、與生物大分子和細(xì)胞作用明顯等優(yōu)點(diǎn)。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ARTP誘變技術(shù)對(duì)遺傳物質(zhì)的損傷機(jī)制多樣，能夠快速地突變細(xì)菌、真菌、酵母等微生物，獲得多種突變型[14-16]。

本實(shí)驗(yàn)室前期已篩選出一株能利用木糖產(chǎn)L-乳酸的野生型凝結(jié)芽孢桿菌菌株NL01，其最大的特點(diǎn)是所產(chǎn)L-乳酸的光學(xué)純度很高。為了進(jìn)一步提高該菌株的木糖耐受能力以及L-乳酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，本研究通過等離子體誘變和高糖高酸平板篩選突變菌株，并對(duì)正向突變菌株的發(fā)酵特性進(jìn)行研究，以期為今后利用生物質(zhì)資源生產(chǎn)L-乳酸的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）NL01，誘變?cè)季?，由南京林業(yè)大學(xué)生物化工研究所保存提供。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：木糖20 g/L、酵母膏2 g/L、玉米漿干粉2.5 g/L、氯化銨1 g/L、無水硫酸鎂0.2 g/L、碳酸鈣20 g/L，pH 7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖100 g/L、酵母膏2.5 g/L、玉米漿干粉5 g/L、氯化銨1 g/L、無水硫酸鎂0.5 g/L、碳酸鈣70 g/L，pH 7.2。高糖高酸篩選培養(yǎng)基：木糖100 g/L、乳酸10 g/L、酵母膏2.5 g/L、玉米漿干粉5 g/L、氯化銨1 g/L、無水硫酸鎂0.5 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.2。

1.3 儀器與設(shè)備

FE20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；Aminex HPX-87有機(jī)酸離子交換柱 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 離子注入誘變

菌體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，加無菌水稀釋至細(xì)胞密度OD600nm值略大于1，將稀釋好的菌懸液進(jìn)行誘變，誘變采用的是清華大學(xué)研制的ARTP-Ⅱ型育種機(jī)。誘變條件為功率100 W、輻照距離2.5 mm、氦氣通量10 L/min、輻照時(shí)間分別為30、60、90、120、180 s。誘變完成后，用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋后涂布LB平板，再將平板倒置于50℃恒溫箱中培養(yǎng)2 d左右，挑取單菌落進(jìn)行后期發(fā)酵測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

1.5 菌株的篩選

將出發(fā)菌株菌懸液接至LB液體培養(yǎng)基，搖床活化22～24 h后，涂于含不同質(zhì)量濃度乳酸鈣和木糖的培養(yǎng)平板，50℃培養(yǎng)24 h，觀察菌體生長(zhǎng)情況，得到出發(fā)菌株的乳酸和木糖臨界抑制質(zhì)量濃度，由此確定篩選平板。誘變后，從高糖高酸平板上篩選突變菌株。

1.6 分析方法

1.6.1 pH值的測(cè)定采用實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)測(cè)定溶液pH值。

1.6.2 生物量的測(cè)定采用比濁法，紫外分光光度計(jì)測(cè)菌液OD600nm值。

1.6.3 木糖及L-乳酸的測(cè)定采用Agilent 1200型高效液相色譜儀，Aminex HPX-87有機(jī)酸離子交換柱，以5 mmol/L硫酸為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，柱溫55℃，示差折光檢測(cè)，進(jìn)樣量10 μL。

L-乳酸相對(duì)產(chǎn)量：是相對(duì)最高產(chǎn)量得到的百分?jǐn)?shù)，以最高真實(shí)產(chǎn)量為100%。

1.6.4 糖酸轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

1.6.5 存活率的計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株的生長(zhǎng)曲線

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌N L 01的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of B. coagulans NL01

凝結(jié)芽孢桿菌NL01在LB液體培養(yǎng)基中，恒溫50℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線如圖1所示，菌株大約在生長(zhǎng)8 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，25 h后結(jié)束對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期。在實(shí)際育種工作中，常選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后期的細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體進(jìn)行誘變處理，此時(shí)的細(xì)菌不但菌體濃度合適、生理狀態(tài)同步，而且對(duì)理化因素敏感，有利于誘變處理[17]。故本實(shí)驗(yàn)中使用生長(zhǎng)了22～24 h的細(xì)胞作為誘變用出發(fā)菌種。

2.2 出發(fā)菌株乳酸和木糖臨界抑制質(zhì)量濃度

出發(fā)菌株凝結(jié)芽孢桿菌NL01經(jīng)種子培養(yǎng)基活化后，稀釋一定倍數(shù)涂布于含不同質(zhì)量濃度木糖和乳酸鈣的培養(yǎng)基平板上，50℃恒溫培養(yǎng)1～2 d后，結(jié)果如表1所示。

表1 出發(fā)菌株乳酸與木糖臨界抑制質(zhì)量濃度Table 1 Critical inhibitory concentration of lactic acid and xylose for strain NL01

由表1可知，出發(fā)菌株在含30 g/L乳酸鈣和100 g/L木糖的平板上表現(xiàn)出嚴(yán)重抑制現(xiàn)象。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中高糖高酸篩選平板配方中木糖和乳酸鈣的質(zhì)量濃度分別選擇100 g/L和30 g/L。

2.3 出發(fā)菌株的誘變和篩選

2.3.1 出發(fā)菌株的誘變條件確定

圖2 凝結(jié)芽孢桿菌NL01離子誘變存活曲線Fig.2 Ion mutagenesis survival curve of B. coagulans NL01

根據(jù)誘變理論研究，80%～90%的致死率有利于正突變菌株的產(chǎn)生[18-20]，并且此時(shí)等離子的注入在離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，激活了細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制和修復(fù)所需要的酶[21-23]，故本實(shí)驗(yàn)選擇存活率為17%左右、輻照60 s的菌液平板挑取單菌落進(jìn)行發(fā)酵測(cè)定。

2.3.2 誘變突變株的發(fā)酵性能及高產(chǎn)菌的篩選

從離子注入誘變后的篩選平板挑取100株長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株活化12 h，以木糖為唯一碳源發(fā)酵72 h，初始糖質(zhì)量濃度為100 g/L，發(fā)酵72 h，最后通過對(duì)比L-乳酸產(chǎn)量及其糖酸轉(zhuǎn)化率，選定了NL-CC-17、NL-CC-25、NL-CC-37、NL-CC-54、NL-CC-89這5株菌又進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵能力測(cè)試，結(jié)果如表2所示，在L-乳酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率對(duì)比的基礎(chǔ)上，又利用高效液相色譜對(duì)其乳酸光學(xué)純度進(jìn)行了綜合對(duì)比，最后選定菌株NL-CC-17進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

表2 誘變后菌株的木糖發(fā)酵能力Table 2 Xylose fermentation capacity for mutant strains

2.3.3 對(duì)篩選出的菌種進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為了鑒定篩選到的高產(chǎn)菌能否穩(wěn)定地遺傳，對(duì)菌株NL-CC-17做了遺傳穩(wěn)定性考察。每代實(shí)驗(yàn)過程為：高產(chǎn)菌株→種子培養(yǎng)→搖瓶發(fā)酵→種子培養(yǎng)→搖瓶發(fā)酵，第2次發(fā)酵的接種液為上1次發(fā)酵72 h的發(fā)酵液。發(fā)酵72 h后測(cè)L-乳酸產(chǎn)量。共傳5代，每代均做3個(gè)平行，結(jié)果見表3。

表3 菌株NL-CC-17的發(fā)酵穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 3 Fermentation stability of strain NL-CC-17

由表3可知，第一代產(chǎn)酸能力較弱，這是因?yàn)榈谝淮甑慕臃N液是來自超低溫冰箱里保存的種液，活力較差。但是其他幾代的乳酸產(chǎn)量基本維持在82 g/L左右。ARTP的誘變機(jī)理是采用含有多種化學(xué)活性粒子的氦氣使DNA等造成遺傳物質(zhì)損傷，微生物啟動(dòng)SOS修復(fù)機(jī)制進(jìn)行容錯(cuò)性修復(fù)，因此，ARTP多樣性的損傷將可能在修復(fù)過程中包容于DNA鏈中并使其穩(wěn)定的遺傳下去[21-23]?；诖?，通過等離子體誘變技術(shù)獲得的凝結(jié)芽孢桿菌突變株遺傳穩(wěn)定性較好。與對(duì)照相比，突變株最高產(chǎn)量為83.20 g/L，L-乳酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了21.51%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了16.00%。

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌木糖發(fā)酵性能的研究

2.4.1 木糖質(zhì)量濃度對(duì)菌株NL-CC-17發(fā)酵性能的影響

圖3 不同木糖質(zhì)量濃度發(fā)酵生產(chǎn)L--乳酸（A）及其殘?zhí)牵˙）隨時(shí)間的變化Fig.3 Effects of different initial xylose concentrations on L-lactic acid (A) and redidual sugar (B) production

測(cè)試誘變篩選后的菌種利用木糖發(fā)酵的能力，設(shè)置木糖質(zhì)量濃度分別為60、80、100、120、140、160 g/L，每隔24 h取樣，發(fā)酵5 d，測(cè)定木糖及其L-乳酸的產(chǎn)量并繪制發(fā)酵曲線。由圖3A、B可知，在木糖質(zhì)量濃度為100 g/L時(shí)，發(fā)酵120 h木糖基本被利用完全，L-乳酸產(chǎn)量為81.28 g/L，隨著木糖質(zhì)量濃度的升高，L-乳酸產(chǎn)量降低，發(fā)酵受到抑制，分析原因可能為高質(zhì)量濃度的木糖對(duì)菌株細(xì)胞的滲透壓有影響，從而影響整個(gè)代謝過程。

以往文獻(xiàn)[24]報(bào)道，凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵木糖的底物最高耐受質(zhì)量濃度約為70～80 g/L，與本實(shí)驗(yàn)野生型菌株實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。經(jīng)過等離子體誘變后，菌株的木糖耐受質(zhì)量濃度明顯提高，可以在100 g/L的底物質(zhì)量濃度下快速代謝木糖，突變效果良好。突變菌株凝結(jié)芽孢桿菌NL-CC-17是目前報(bào)道的木糖利用能力最好的菌株。

2.4.2 發(fā)酵條件對(duì)菌株NL-CC-17的影響

溫度和pH值是影響發(fā)酵產(chǎn)量的重要條件，凝結(jié)芽孢桿菌屬于耐熱菌，生長(zhǎng)溫度可達(dá)55℃以上，而且其發(fā)酵pH值較低。本實(shí)驗(yàn)研究了溫度在35～60℃、pH值在5.5～7.5范圍內(nèi)的發(fā)酵條件對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖4和圖5。

圖4 不同溫度對(duì)L-乳酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of temperature on L--lactic acid production

圖5 不同起始pHH值對(duì)L-乳酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of initial pH on L--lactic acid production

由圖4可知，L-乳酸的產(chǎn)量和糖利用率隨發(fā)酵溫度的變化非 常明顯，當(dāng)發(fā)酵溫度為50℃時(shí)，L-乳酸產(chǎn)量和糖利用率均達(dá)到最高點(diǎn)，當(dāng)發(fā)酵溫度升高到55℃時(shí)L-乳酸的產(chǎn)量有明顯的降低，只有17.75 g/L。因此，此菌的最適發(fā)酵溫度為50℃。由圖5可知，隨著起始pH值的升高，L-乳酸的產(chǎn)量逐步降低，糖酸轉(zhuǎn)化率亦下降，在pH 5.5時(shí)L-乳酸產(chǎn)量最高，為73.43 g/L，因此pH 5.5為實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)最佳發(fā)酵pH值。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)目前L-乳酸生產(chǎn)菌株在木糖利用上的缺陷，以野生型凝結(jié)芽孢桿菌NL01作為出發(fā)菌株，采用等離子體誘變育種技術(shù)選育出了一株木糖發(fā)酵特性優(yōu)良的L-乳酸高產(chǎn)菌株NL-CC-17，該菌株是目前報(bào)道的木糖利用能力最好的菌株。

3.1 凝結(jié)芽孢桿菌NL01的木糖臨界抑制質(zhì)量濃度為100 g/L，乳酸鈣臨界抑制質(zhì)量濃度為30 g/L。由此確定高糖高酸篩選平板配方中木糖和乳酸鈣的質(zhì)量濃度分別為100 g/L和30 g/L。

3.2 通過等離子體誘變育種技術(shù)對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌NL01進(jìn)行誘變處理，研究了不同注射時(shí)間下菌株的存活率，控制離子注入機(jī)功率在100 W左右，輻照距離2.5 mm，氦氣通量10 L/min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示最佳輻照時(shí)間為60 s。經(jīng)木糖發(fā)酵測(cè)定，L-乳酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了21.51%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了16.00%。

3.3 通過對(duì)木糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的初步優(yōu)化，確定了木糖的最適初始質(zhì)量濃度為100 g/L，最適發(fā)酵溫度為50℃，實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)最適發(fā)酵pH值為5.5。

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Improved Xylose Utilization of Bacillus coagulans by Atmospheric and Room Temperature Plasma Mutation for Production of Lactic Acid

CAI Cong1,2, JIANG Ting2, ZHENG Zhao-juan2, OUYANG Jia1,2,*
(1. College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. Jiangsu Key Laboratory of Biomass-based Green Fuels and Chemicals, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

To further enhance the production and yield of converting xylose to L-lactic acid, an atmospheric- and room temperature-plasma (ARTP) mutation system was employed to induce the mutation of Bacillus coag ulans NL01, a wild-type strain for production of L-lactic acid from xylose. A positive mutant, named as NL-CC-17, was obtained through enrichment and screening. Compared with that of previously reported strains, NL-CC-17 had an improved tolerance to xylose. This strain was capable of converting 100 g/L xylose into 82.30 g/L L-lactic acid after being cultured at 50 ℃ for 72 h with a yield of 92.37%. The concentration of L-lactic acid was increased by 21.51% and the yield by 16.00%. After preliminary optimization of fermentation conditions, the optimal fermentation temperature was determined as 50 ℃ and the optimal pH as 5.5.

atmospheric and room temperature plasma (ARTP); Bacillus coagulans; mutation; L-lactic acid; xylose

Q815

A

1002-6630(2014)01-0125-05

10.7506/spkx1002-6630-201401024

2012-11-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31200443）；江蘇省杰出青年基金項(xiàng)目（BK2012038）；國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA022301）

蔡聰（1987—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：caicong1987@163.com

*通信作者：歐陽嘉（1972—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槊概c發(fā)酵工程。E-mail：hgouyj@njfu.edu.cn