范寶妍 朱海波

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“新藥作用機(jī)制研究與藥效評(píng)價(jià)”北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

高脂血癥是體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂而形成的血漿中一種或多種脂質(zhì)含量超過(guò)正常值的一種病癥，其中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，臨床上控制循環(huán)中脂質(zhì)水平是防治心腦血管疾病的必要手段[1]。但已上市的一線化藥，如他汀類(lèi)、貝特類(lèi)等，其不良反應(yīng)限制了其應(yīng)用范圍[2]。因此具有調(diào)血脂功效的天然產(chǎn)物逐步受到重視。

大黃素是中藥大黃的主要有效成分，中醫(yī)傳統(tǒng)認(rèn)為大黃具有攻積滯、清濕熱、瀉火、涼血等功效，近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道大黃素也具有抗氧化、抗腫瘤、保肝、抗菌等作用[3]。本研究建立實(shí)驗(yàn)性高脂血癥金黃地鼠模型，觀察大黃素對(duì)高脂血癥的改善作用，并結(jié)合脂蛋白譜分析及核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)，尋找大黃素改善脂質(zhì)代謝的精細(xì)差異，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)敘利亞金黃地鼠，雄性，體重90～110 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供， 合格證號(hào)：SCXK（京）2006-0009。

1.2 飼料

基礎(chǔ)飼料與高脂飼料均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。 高脂飼料配方：由基礎(chǔ)飼料添加0.2%膽固醇，20%動(dòng)物脂肪重新制粒，滅菌封裝。

1.3 模型與分組給藥

動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1 周后， 根據(jù)體重隨機(jī)分成4 組，分別為正常對(duì)照組（Con 組）、模型對(duì)照組（HFD組）、陽(yáng)性對(duì)照組（Simvastatin 組）及大黃素組（Emodin 組）。高脂飼料造模1 周（Con 組給予普通飼料）后開(kāi)始給藥。 各給藥組每天灌胃給藥1 次，Simvastatin 組給予辛伐他汀6 mg/kg，Emodin 組給于大黃素70 mg/kg。Con 組、HFD 組每天給予等體積的蒸餾水。

1.4 藥物與試劑

辛伐他汀購(gòu)自杭州默沙東制藥有限公司 （批號(hào)：120945），總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇 （HDL-C）、LDL-C 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。 Amplex Red、Nile Red染料購(gòu)自Sigma 公司，其余分析純?cè)噭┚?gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

1.5 儀器

熒光酶標(biāo)儀，美國(guó)MD 公司；AKATA Purifier 10 System、900 fraction collector、Superdex 200、Superose 6，GE 公司；Bruker AVANCE Ⅲ-500 超導(dǎo)傅立葉變化核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司。

1.6 生化指標(biāo)檢測(cè)

于給藥第28 天動(dòng)物眼眶靜脈取血（禁食12 h），參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中血脂指標(biāo)。

1.7 血清脂蛋白的分離和脂質(zhì)熒光檢測(cè)

用3%戊巴比妥鈉溶液麻醉動(dòng)物后， 采集腹主動(dòng)脈血液，分裝至含1%肝素鈉的EP 管中。 參照文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行血漿脂蛋白分離及脂質(zhì)熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.8 核磁共振代謝組學(xué)

取血漿30 μL，添加生理鹽水后混勻，離心后取上清60 μL 加入1.7 mm 核磁樣品管中， 于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?在Bruker VARIAN Ⅲ-500 超導(dǎo)傅立葉變化核磁共振波譜儀上， 血漿樣品調(diào)用NOESY 脈沖序列、 弛豫時(shí)間編輯 （Carr-Purcell-Meiboom-Gill，CPMG）和擴(kuò)散編輯（longitudinal eddy-delay，LED）相關(guān)脈沖序列，采用預(yù)飽和方式抑制水峰，預(yù)飽和時(shí)間為2 s ，譜寬8000 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)32 k，累加次數(shù)128 次，預(yù)飽和頻率和中心頻率都在水峰位置。自由感應(yīng)衰減（free induction decay，F(xiàn)ID）信號(hào)經(jīng)過(guò)32 k 點(diǎn)傅立葉變換轉(zhuǎn)為一維NMR 譜圖。 以TSP 為化學(xué)位移參考峰的位置，設(shè)為0。 調(diào)用AMIX（Analysis of MIXtures software v.3.0，Bruker Biospin） 軟件中的程序?qū)?H-NMR圖譜按5～0.5 的范圍進(jìn)行分段積分，每段為0.04。 將積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化之后， 用SIMCA-P12.0 軟件包進(jìn)行模式識(shí)別分析及皮爾森相關(guān)性分析。采用主成分分析（principal components analysis，PCA）觀察試驗(yàn)樣品的自然分布和組別關(guān)系， 為進(jìn)一步區(qū)分不同組別差異，采用偏最小方差判別分析 （partial least squares discriminate analysis，PLS-DA）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 5 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對(duì)金黃地鼠血脂水平影響

與Con 組 比 較， 給 藥4 周 后HFD 組TC、TG、LDL-C 水平均顯著升高（P < 0.05）；與HFD 組相比，Simvastatin 組給藥4 周后TC、TG、LDL-C 水平明顯下降（P<0.05），大黃素在70 mg/kg 劑量下的血清TC、TG及LDL-C 水平與HFD 組相比有顯著性降低（P<0.05），但對(duì)HDL-C 水平無(wú)顯著影響（P > 0.05）。 見(jiàn)表1。

2.2 高脂血癥金黃地鼠脂蛋白差異譜繪制

Con 組、HFD 組、Simvastatin 組和Emodin 組的金黃地鼠血清脂蛋白譜具有顯著差異（圖1A～D）。 將紫外吸收數(shù)值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白回歸公式計(jì)算獲得各組脂蛋白含量與Con 組相比，HFD 組VLDL 及LDL 含量明顯升高，HDL 含量明顯降低，VLDL 及LDL 中脂質(zhì)成分TC及TG 的含量明顯升高， 差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；給予辛伐他汀后能顯著降低VLDL 及LDL 水平，降低VLDL 中TC、TG 的含量，降低LDL 中TC 含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；給予大黃素能顯著降低高脂血癥金黃地鼠血清VLDL 水平，升高HDL 水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 大黃素可降低VLDL 及HDL中TG 的含量，降低VLDL 中TC 含量，升高HDL 中TC含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 見(jiàn)圖1 E～G。

表1 大黃素對(duì)高脂血癥地鼠血清血脂含量的影響（mg/dL，±s）

表1 大黃素對(duì)高脂血癥地鼠血清血脂含量的影響（mg/dL，±s）

注：與Con 組比較，##P<0.01，###P<0.001；與HFD 組比較，*P<0.05，**P < 0.01；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇

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圖1 高脂血癥金黃地鼠脂蛋白譜

2.3 NMR 代謝組學(xué)研究結(jié)果

應(yīng)用核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)，從CPMG、LED 實(shí)驗(yàn)及模式識(shí)別分析發(fā)現(xiàn)，HFD 組血漿中HDL （δ 0.86）、乳酸（δ 1.34、4.1、4.14）、乙酸（δ 1.94）、丙氨酸（δ 1.50）、葡萄糖（δ 3.42～3.98）、賴(lài)氨酸（δ1.70、3.02）、檸檬酸（δ 2.54）、磷脂酰膽堿（δ 3.22）、不飽和脂肪酸（δ 2.78、2.82） 等含量較低， 而VLDL/LDL （δ 0.9、0.94、1.34、1.38）、N-乙酰糖蛋白 （δ 2.02、2.06）、 甲硫氨酸（δ 2.14）、甜菜堿（δ 3.30）等含量較高，Con 組和HFD 組能明顯區(qū)分。給予辛伐他汀及大黃素后內(nèi)源性小分子和大分子代謝物均表現(xiàn)向正常狀態(tài)回歸的趨勢(shì)。見(jiàn)圖2、3。

圖2 血漿1H-NMR CPMG 實(shí)驗(yàn)PLS-DA 得分及載荷圖

圖3 血漿1H-NMR LEDBP 實(shí)驗(yàn)PLS-DA 得分及因子載荷圖

3 討論

高脂血癥作為腦卒中、冠心病、心肌梗死等的危險(xiǎn)因素之一，進(jìn)行早期控制，減少并發(fā)癥發(fā)生，是降低患者心血管事件發(fā)生的有效控制手段。本研究采用高脂血癥動(dòng)物模型， 觀察大黃素對(duì)血脂紊亂的改善作用，研究結(jié)果表明，大黃素70 mg/kg 給藥可以改善動(dòng)物模型血脂紊亂，降低血清脂質(zhì)含量。

調(diào)血脂藥物的藥效評(píng)價(jià)需要建立可靠的血脂代謝紊亂動(dòng)物模型，豚鼠和金黃地鼠兩種動(dòng)物具有成本較低、造模時(shí)間較短的優(yōu)點(diǎn)，因此目前國(guó)際上趨向于采用上述兩種動(dòng)物來(lái)建立高脂模型研究血脂代謝相關(guān)疾病[5]。通過(guò)前期的研究發(fā)現(xiàn)，金黃地鼠的脂蛋白譜特征與人類(lèi)更為相似，并已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于脂代謝研究中[4]。 因此，本研究采用金黃地鼠，結(jié)合喂養(yǎng)給予高脂飼料后誘導(dǎo)動(dòng)物發(fā)生血脂增高，建立接近于人類(lèi)高脂血癥發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型。 從結(jié)果分析，金黃地鼠給予高脂飼料后，血脂水平顯著升高。血清指標(biāo)：模型組血清TC、TG、LDL-C 含量升高， 與同期正常組相比，有顯著性差異。采用該模型觀察，大黃素顯著降低血清TC、TG 和LDL-C 水平，顯示出顯著地改善血脂紊亂作用，并且大黃素并未降低血清中HDL-C 含量，提示大黃素在降低血清脂質(zhì)的同時(shí)， 不影響HDL-C水平。由于高密度脂蛋白的主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇排出，是一種抗動(dòng)脈粥樣硬化的血漿脂蛋白，是冠心病的保護(hù)因子[6]。 據(jù)此推測(cè)，大黃素改善HDL-C 功能的性質(zhì)可能對(duì)心血管疾病的治療有積極意義。

脂蛋白是TG、膽固醇、膽固醇酯和磷脂等與不同載脂蛋白形成的功能性復(fù)合體[7]，其中的脂質(zhì)成分除了為機(jī)體提供能量，還參與了細(xì)胞成分構(gòu)建和信號(hào)傳遞等重要的生理生化過(guò)程[8]。 機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)存在于不同的載體上，代表著不同的代謝狀態(tài)，脂蛋白的含量和脂質(zhì)運(yùn)載情況能直觀反映這種代謝差異。本研究采用分子篩凝膠色譜法對(duì)微量血清中脂蛋白進(jìn)行分離，將脂蛋白VLDL、LDL 峰群與HDL 峰完全分離， 提高了脂蛋白分析的精確性[5]。本研究結(jié)果顯示，不同脂蛋白組分中脂質(zhì)含量存在差異。 給予大黃素使血清VLDL 中TC 和TG 含量顯著下降，但LDL 轉(zhuǎn)運(yùn)TG 的能力較強(qiáng)，而HDL 轉(zhuǎn)運(yùn)TC 的作用更加突出。 脂蛋白譜不僅驗(yàn)證了生化指標(biāo)變化的結(jié)果，同時(shí)能精細(xì)分析大黃素對(duì)不同脂蛋白功能的改變，因此本研究進(jìn)一步分析了大黃素對(duì)HDL 功能影響。

HDL 是一種獨(dú)特的脂蛋白， 具有明確的抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，并因此獲得具有“抗動(dòng)脈粥樣硬化性脂蛋白”的美稱(chēng)，但是以Torcetrapib 為代表的藥物，通過(guò)增加高密度脂蛋白濃度來(lái)改善冠心病的藥物卻遭受失敗的重創(chuàng)[9]。 因此，反思CEPT 抑制劑的開(kāi)發(fā)歷程，研究人員發(fā)現(xiàn)，單純提高高密度脂蛋白數(shù)量，不能夠等同于心血管事件的降低，而高密度脂蛋白功能卻被忽視了。 最新的研究表明，高密度脂蛋白功能的提升，有助于改善實(shí)驗(yàn)性心血管事件的發(fā)生[10]。 通過(guò)脂蛋白譜結(jié)合脂質(zhì)檢測(cè)分析，大黃素治療后，金黃地鼠血清HDL 運(yùn)載TC、TG 的能力顯著提高。 提示其可能具有調(diào)節(jié)HDL 功能改善血脂代謝紊亂的作用， 具體的機(jī)制仍需后續(xù)研究補(bǔ)充。

采用代謝組學(xué)方法研究?jī)?nèi)源性物質(zhì)的變化及代謝輪廓的變化， 不僅可以觀察到傳統(tǒng)指標(biāo)的變化，還可以觀察到糖、氨基酸代謝狀態(tài)的改變，可以加深對(duì)疾病狀態(tài)下機(jī)體組織功能的改變，也是全面評(píng)價(jià)藥物的新手段，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)生化指標(biāo)檢測(cè)的不足之處[11-12]。

研究表明，與正常動(dòng)物相比，高脂血癥金黃地鼠的糖、脂及氨基酸代謝均有明顯變化在糖代謝方面，三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物乳酸及檸檬酸濃度的降低表明糖酵解速率改變， 三羧酸循環(huán)減弱； 在脂代謝方面，F(xiàn)C、FFA 明顯升高，與生化檢測(cè)結(jié)果一致，合成脂蛋白的膽堿類(lèi)化合物及不飽和脂肪酸含量下降；在氨基酸代謝方面， 模型組甲硫氨酸和甜菜堿濃度升高，表明體內(nèi)甲硫氨酸循環(huán)增強(qiáng)，可能導(dǎo)致致動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素——同型半胱氨酸的升高[13]。 N-乙酰糖蛋白的增高提示炎性反應(yīng)發(fā)生。 大黃素可降低TG、游離膽固醇以及酯化膽固醇、游離脂肪酸含量，使膽堿化合物磷脂酰膽堿含量升高， 后者是合成脂蛋白HDL 的重要成分[14]。大黃素促進(jìn)脂蛋白合成，防止膽固醇在肝臟內(nèi)的堆積。 卵磷脂使血液中膽固醇及TG 含量降低， 減少由膽固醇引起的血管內(nèi)膜損傷，抑制粥樣硬化斑塊生成[15]。 大黃素升高卵磷脂含量，有助于降低血中TC、TG 含量，利于預(yù)防及治療心血管疾病。

本研究顯示，大黃素具有顯著改善高脂血癥金黃地鼠血脂代謝紊亂的作用，使血清脂蛋白譜向正?；貧w，且能夠增加高密度脂蛋白的脂質(zhì)運(yùn)載能力，代謝組學(xué)研究結(jié)果表明，大黃素可調(diào)節(jié)血脂水平紊亂動(dòng)物的血漿內(nèi)源性代謝物代謝輪廓向正?；貧w。提示大黃素在治療高脂血癥方面具有深入研究?jī)r(jià)值。

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