張慧蕓，陳俊亮，康懷彬

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

發(fā)酵對幾種谷物提取物總酚及抗氧化活性的影響

張慧蕓，陳俊亮，康懷彬

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

目的：研究發(fā)酵對谷物提取物抗氧化活性的影響。方法：采用德氏乳桿菌和啤酒酵母菌分別對小米、燕麥、黑米、高粱米4種谷物進行發(fā)酵，福林-酚法測定未發(fā)酵及發(fā)酵后谷物乙醇提取物總酚含量、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydraz yl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）法測定清除自由基能力、鐵還原抗氧化能力（ferric reducing-antioxidant power，F(xiàn)RAP）法測定還原能力、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法測定脂質(zhì)過氧化抑制能力。結(jié)果：4種谷物提取物具有顯著的清除自由基能力、鐵離子還原能力、抑制脂質(zhì)過氧化能力和較高的總酚含量；經(jīng)兩種微生物發(fā)酵后谷物提取物總酚含量增加，具有更高抗氧化活性；其中德氏乳桿菌發(fā)酵對總酚含量及抗氧化能力影響均顯著（P＜0.05）；啤酒酵母發(fā)酵對總酚含量影響顯著（P＜0.05），但對抗氧化能力影響不顯著（P＞0.05）。結(jié)論：微生物發(fā)酵可提高谷物的總酚含量及抗氧化活性，但提高的程度與發(fā)酵采用的微生物種類有關(guān)。

發(fā)酵；谷物提取物；總酚；抗氧化

近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，谷物及谷物食品中含有大量的多酚類化合物，包括酚酸、 黃酮類化合物和原花青素等，這些多酚類化合物具有很強的抗氧化活性[1-5]，開發(fā)潛力極大。小米、高粱中的酚類化合物具有很強的抗氧化能力，尤其是清除自由基和螯合金屬離子能力[6-7]。黑米亦含有大量酚類化合物，能有效地清除過氧自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基，有效地控制低密度脂蛋白膽固醇的氧化，在抗氧化保健品開發(fā)方面具有很大潛力[8]。研究表明，具有抗氧化活性的谷物食品有助于減少與衰老有關(guān)慢性疾病的發(fā)生率，包括心臟病和某些癌癥[9]。另一方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)谷物中含有一定量的抗營養(yǎng)成分，影響其生物可利用性，如不易溶解、消化的植酸鹽類、阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖等抗營養(yǎng)因子[10]。發(fā)酵長期以來被作為一種提高產(chǎn)品性能的方法，微生物發(fā)酵過程可以改性植物組分[11]；發(fā)酵過程中產(chǎn)生許多生物化學變化，從而可以改變植物中營養(yǎng)組分和抗營養(yǎng)組分的比例，提高產(chǎn)品的生物活性和消化性等[12-13]。Juan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，黑豆在經(jīng)過枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵后總酚和總黃酮的含量都有增加。Moore等[15]研究發(fā)現(xiàn)，麥麩經(jīng)酵母菌固態(tài)發(fā)酵后抗氧化活性提高。本實驗研究了酵母菌發(fā)酵和乳酸菌發(fā)酵對4種谷物提取物抗氧化活性和總酚含量的影響，以期為開發(fā)谷物抗氧化食品提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）和德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）ATCC7830 河南科技大學食品與生物工程學院實驗室保存菌種。

MRS培養(yǎng)基和胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責任公司。

1.2 材料與試劑

小米、高粱米、燕麥 洛陽市呂昌谷業(yè)有限公司，產(chǎn)地河南省洛陽市伊川縣；黑米 河南黑谷源土特產(chǎn)品開發(fā)有限公司，產(chǎn)地河南省洛陽市宜陽縣。

大豆卵磷脂、Fe3+-三吡啶三吖嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）、DPPH 美國Sigma公司；氯仿、三氯乙酸、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、沒食子酸、福林酚試劑 中國醫(yī)藥集團（上海）化學試劑公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物菌種的培養(yǎng)

L. delbrueckii和S. cerevisiae凍干粉分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基（37℃，24h）和胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基中（30℃，24h）進行活化，活化3次后接種于谷物樣品中。

1.3.2 谷物提取物的制備

谷物100g在室溫下于蒸餾水中浸泡24h后過濾，加入400 mL蒸餾水研磨得漿狀物于高壓鍋中殺菌1h，然后冷卻至室溫。每種谷物樣品分為3組：第1組接種5mL L. delbrueckii，第2組接種5mL S. cerevisiae，第3組不接種。3組谷物樣品均于30 ℃發(fā)酵24h。發(fā)酵后加入700 mL 70%乙醇磁力攪拌3h，4500 r/min離心10 min，殘渣加入300 mL 70%乙醇重提3h后，4500 r/min離心10 min。合并濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（60 ℃）中濃縮，取出濃縮液在60 ℃烘箱中干燥，得到谷物提取物，避光保存于4 ℃冰箱中待用。

1.3.3 總酚含量的測定

參考Wu[16]和Djeridane[17]等的方法，稍加改進。100μL樣品置10 mL容量瓶中，加入福林酚試劑500μL，加蒸餾水至約6 mL，于漩渦混合器中混合，在1～8 min內(nèi)加15g/100 mL碳酸鈉溶液2 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，于漩渦混合器中混合，2h后在765nm波長處測定吸光度。以沒食子酸作標準品代替樣品作標準曲線，樣品中的總酚含量以沒食子酸的含量表示，單位為mg/g。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

參考Larrauri等[18]的方法并進行改進。吸取0.1 mL 200μg/mL的谷物提取物，加入0.5 mL 50g/L 的DPPH-甲醇溶液，用甲醇定容至5 mL。室溫下避光靜置1h后于517nm波長處測定吸光度。樣品對DPPH自由基的清除率用下式表示。

式中：A為樣品溶液的吸光度；A0為空白溶液的吸光度。1.3.5 鐵還原抗氧化能力（ferric reducing-antioxidant power，F(xiàn)RAP）法測定抗氧化能力

參照Benzie等[19]的方法，在反應(yīng)管中加入0.1 mL 200μg/mL的谷物提取物，再準確加入3 mL FRAP工作液，300μL雙蒸水，混勻，準確反應(yīng)8 min，于593nm波長處讀取吸光度，95%食用酒精調(diào)零。以100～1000μmol/L FeSO4·7H2O制作標準曲線。樣品的抗氧化活性（FRAP值）以達到同樣吸光度所需的FeSO4毫摩爾數(shù)表示，每份試樣重復測定3次。FRAP工作液現(xiàn)用現(xiàn)配，由pH3.6的100 mL 30mmol/L醋酸鹽緩沖液、10 mL 10mmol/L TPTZ溶液和10 mL 20mmol/L FeCl3·6H2O溶液混合在一起組 成。

1.3.6 抗脂質(zhì) 過氧化能力的測定

脂質(zhì)體由大豆卵磷脂制得，采用Decker等[20]的方法進行一些改進。將大豆卵磷脂溶解（200mg/L）在0.12mol/L KCl、5mmol/L組氨酸緩沖溶液（pH6.8）均質(zhì)后，4 ℃條件下進行45 min超聲波處理，以促其溶解[21]。

將5 mL脂質(zhì)體溶液和1 mL 200μg/mL的谷物提取物混合。對照為用1 mL 70%乙醇代替1 mL谷物提取物與5 mL脂質(zhì)混合。加入0.1 mL 50mmol/L FeCl3和0.1 mL 10mmol/L抗壞血酸鈉引發(fā)脂質(zhì)氧化，然后將樣品放在37 ℃水浴中保溫1h，其氧化程度由TBA法測定。樣品溶液與0.02mol/L TBA反應(yīng)后，與氯仿體積比1∶1混合，旋渦振蕩，1800×g離心10 min。取上清測定在532nm波長處的吸光度。抗脂質(zhì)氧化能力的計算公式同1.3.4節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)均為3次重復的平均值，用Statistix 8（分析軟件，St Paul，MN）進行數(shù)據(jù)分析，平均數(shù)之間顯著性差異（P＜0.05） 通過最小顯著差值進行，用Sigmaplot9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵對谷物提取物總酚含量的影響

圖1 發(fā)酵對4種谷物提取物總酚含量的影響Fig.1 Effect of fermentation on total polyphenolics of cereal extracts

如圖1所示，所測未發(fā)酵谷物提取物中黑米中總酚含量最高為18.7mg/g，小米和高粱中總酚含量較低分別為16.9mg/g和16.4mg/g，燕麥中總酚含量最低為14.2mg/g。發(fā)酵可提高谷物中所含生物活性成分含量，經(jīng)S. cerevisiae和L. delbrueckii發(fā)酵后，黑米提取物總酚含量分別提高了16%和40.6%，高粱提取物總酚含量分別提高了14.6%和25%，小米提取物總酚含量分別提高了11.2%和25.4%，燕麥提取物總酚含量分別提高了23.9%和43.7%。結(jié)合酚是谷物酚類化合物的主要存在形式[22-23]，谷物中結(jié)合酚類化合物可在提取之前通過堿、酸或酶處理使其釋放出來[24]，這可能是發(fā)酵后谷物提取物總酚含量增加，具有更高抗氧化活性的主要原因。另外，由于發(fā)酵過程中微生物的代謝活動對植物中生物活性物質(zhì)進行改性，且發(fā)酵可使谷物細胞壁分解，導致各種生物活性物質(zhì)的釋放或合成[13,25]。

2.2 發(fā) 酵對谷物提取物DPPH自由基清除能力的影響

圖2 發(fā)酵對4種谷物提取物DPPH自由基清除能力的影響Fig.2 Effect of fermentation on DPPH radical scavenging activity of cereal extracts

由于此法簡單方便，DPPH自由基已被廣泛用 于分析抗氧化活性成分的自由基清除能力。如圖2所示，未發(fā)酵小米提取物自由基清除能力僅為31%。Linda等[6]研究也表明，小米提取物DPPH自由基清除能力較弱。燕麥和高粱具有較強的DPPH自由基清除能力分別為46.7%和46.6%。黑米提取物具有最強的DPPH自由基清除能力為54.7%。經(jīng)L. delbrueckii發(fā)酵后谷物提取物DPPH自由基清除活性均有所提高，差異顯著（P＜0.05）；而經(jīng)S. cerevisiae發(fā)酵對谷物提取物的DPPH自由基清除活力影響不顯著（P＞0.05）。Moore等[15]研究發(fā)現(xiàn)小麥經(jīng)某種酵母菌發(fā)酵后DPPH自由基清除能力有所增加，但經(jīng)其他類型酵母菌發(fā)酵后其清除能力反而降低，造成這種差別的原因可能是由于不同酵母菌本身具有不同的DPPH自由基清除能力。

2.3 發(fā)酵對谷物提取物還原能力的影響

圖3 發(fā)酵對4種谷物提取物還原能力的影響Fig.3 Effect of fermentation on FRAP of cereal extracts

如圖3所示，未發(fā)酵燕麥提取物FRAP值最高為714.6μmol/L，其次是小米提取物和高粱提取物分別為634.9μmol/L和574.5μmol/L，黑米提取物最低為528.6μmol/L。本研究中只有高粱經(jīng)L. delbrueckii發(fā)酵后其提取物FRAP值顯著增加（P＜0.05），小米、黑米和燕麥經(jīng)L. delbrueckii發(fā)酵前后其提取物FRAP值差異不顯著（P＞0.05）；經(jīng)S. cerevisiae發(fā)酵前后4種谷物提取物FRAP值亦差異均不顯著（P＞0.05），與Hubert等[14]的報道相一致。

2.4 發(fā)酵對谷物提取物抗脂質(zhì)過氧化能力的影響

圖4 發(fā)酵對4種谷物提取物抗脂質(zhì)過氧化能力的影響Fig.4 Effect of fermentation on lipid peroxidation inhibition activity of cereal extracts

如圖4所示，未發(fā)酵燕麥提取物具有最大的抗脂質(zhì)過氧化能力為57.6%，接下來依次為小米和高粱分別為54.5%和51.6%，黑米最低為45.6%。經(jīng)L. delbrueckii發(fā)酵后谷物提取物抗脂質(zhì)過氧化能力顯著提高（P＜0.05），小米、黑米、燕麥和高粱提取物抗脂質(zhì)過氧化能力分別提高了16.0%、11.8%、10.0%和19.4%，而經(jīng)S. cerevisiae發(fā)酵后對其影響不顯著（P＞0.05）。關(guān)于微生物發(fā)酵谷物提取物對脂質(zhì)過氧化抑制效果影響的報道較少，同一種樣品測定抗脂質(zhì)過氧化活性使用的脂質(zhì)體系不同所測得抗氧化活性相差也很大[27]。

3 討 論

不同微生物發(fā)酵對被測谷物中多種生物活性化合物改性的影響不同，這可能由于不同微生物發(fā)酵產(chǎn)生的pH值不同，谷物內(nèi)核細胞壁降解酶的釋放程度不同[28]。Kariluoto等[29]研究亦表明，發(fā)酵通常情況下會提高谷物總多酚含量和谷物提取物的抗氧化活性，但提高的程度與發(fā)酵采用的微生物種類有關(guān)。對抗氧化活性與總酚含量之間的不確定關(guān)系有幾種解釋：1）總酚含量不包括所有抗氧化物，如抗壞血酸、類胡蘿卜素和生育酚；2）不同抗氧化物的協(xié)同作用使其抗氧化活性不僅取決于抗氧化物的含量還要考慮抗氧化物的結(jié)構(gòu)及之間的相互作用，這就是導致具有相似總多酚濃度的樣品其抗氧化活性相差很大的原因；3）不同測定抗氧化活性的方法基于不同的反應(yīng)機制，可能會導致不同的結(jié)果[30]。

本研究結(jié)果表明，谷物具有顯著的清除自由基能力、鐵離子還原能力、抑制脂質(zhì)過氧化能力和較高的總酚含量，谷物食品本身可能包含重要的膳食抗氧化劑，因此，值得進一步研究，以確定這些膳食抗氧化劑是否利于人體健康?？赏ㄟ^微生物對谷物進行發(fā)酵提高其抗氧化活性，發(fā)酵可提高谷物中許多生物活性化合物的含量并可改變谷物中營養(yǎng)成分和抗營養(yǎng)成分的比例以提高產(chǎn)品特性；發(fā)酵類型對谷物生物活性組分具有潛在影響。然而，對谷物發(fā)酵過程中微生物菌群變化和相關(guān)酶活性的變化還需要進行更詳細的研究，以便建立發(fā)酵谷物提高營養(yǎng)價值的明確機制。還需進一步研究發(fā)酵谷物提取物的組成，鑒定其中的抗氧化物質(zhì)，分析谷物產(chǎn)品作為天然抗氧化劑和保健品的潛力；研究影響谷物抗氧化劑在人體中分布、穩(wěn)定性和活性的生物和食品加工條件以便生產(chǎn)出具有最大產(chǎn)品功效的保健食品。

4 結(jié) 論

通過研究兩種不同微生物發(fā)酵對4種谷物提取物總酚含量及抗氧化活性的影響發(fā)現(xiàn)，未發(fā)酵4種谷物提取物具有較強的清除自由基能力、鐵離子還原能力、抑制脂質(zhì)過氧化能力和較高的總酚含量；經(jīng)兩種微生物發(fā)酵后谷物提取物總酚含量增加，具有更高抗氧化活性；其中L. delbrueckii發(fā)酵對總酚含量及抗氧化活性影響均顯著（P＜0.05）；S. cerevisiae發(fā)酵對總酚含量影響顯著（P＜0.05），但對抗氧化活性影響不顯著（P＞0.05）。微生物發(fā)酵可提高谷物的總酚含量及抗氧化活性，但提高的程度與發(fā)酵采用的微生物種類有關(guān)。

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Effect of Fermentation on Total Polyphenol Content and Antioxidant Activity of Cereal Extract

ZHANG Hui-yun, CHEN Jun-liang, KANG Huai-bin
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

The objective of this work was to assay the in uence of different fermentation types (yeast fermentation and lactic acid fermentation) on antioxidant activity and total polyphenol content in selected cereals. After fermented by Lactobacillus delbrueckii, Saccharomyces cerevisiae or nothing, the cereals were extracted by ethanol. The content of total polyphenols in extracts was determined by the Folin-Ciocalteu m ethod, and the antioxidant activity was measured by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging assay, ferric reducing-antioxidant power (FRAP) method and thiobarbituric acid (TBA) test. This study indicated that four cereals used widely for human consumption exhibited signi cant levels of free radical scavenging activity, ferric-reducing power, inhibitory activity against lipid peroxidation and total polyphenol content. These factors suggested that cereal-based foods alone could contain important dietary antioxidants, but further research is needed to determine whether or not these dietary antioxidants could be bene cial to human health. The total polyphenol content (TPC) increased upon fermentation. The presence of these microorganisms was more or less important for enhanced levels of antioxidant activity. Thus fermentation offers a tool to further increase the bioactive potential of cereal products. In conclusion, it seems advantageous to select microorganism starter culture for the fermentation of cereals based on their positive correlation with total antioxidant capacity.

fermentation; cereal extracts; total polyphenol; antioxidant

TS201.2

A

1002-6630（2014）11-0195-05

10.7506/spkx1002-6630-201411039

2013-05-29

張慧蕓（1977—），女，副教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物活性分析。E-mail：zhanghuiyun21@163.com