陳文秀，姜 旋，馬曉燕，張 偉

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)乳粉中的肺炎克雷伯氏菌

陳文秀，姜 旋，馬曉燕，張 偉*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

為了建立食品中肺炎克雷伯氏菌靈敏快速的檢測(cè)方法，根據(jù)GenBank中已公布的肺炎克雷伯氏菌phoE基因設(shè)計(jì)引物，利用實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)儀，建立實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)檢測(cè)食品中肺炎克雷伯氏菌的方法，可直觀(guān)判定檢測(cè)結(jié)果，儀器亦可自動(dòng)顯示檢測(cè)結(jié)果。對(duì)該檢測(cè)方法的特異性、靈敏度等方面進(jìn)行研究，并與聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高。用于特異性實(shí)驗(yàn)的21 株實(shí)驗(yàn)菌株中，4 株肺炎克雷伯氏菌，呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，而其他17 株非肺炎克雷伯氏菌，均呈陰性結(jié)果；檢測(cè)純菌的靈敏度和檢測(cè)人工污染乳粉的檢出限分別為79 CFU/mL和79 CFU/g，是常規(guī)PCR檢測(cè)方法的100 倍?？傊?，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短、結(jié)果判定直觀(guān)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)肺炎克雷伯氏菌的快速檢測(cè)。

肺炎克雷伯氏菌；phoE基因；實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；檢測(cè)；SYBR GreenⅠ

肺炎克雷伯氏菌是Friedlander于1883年從患大葉性肺炎病人的肺組織中分離的一種重要的條件致病菌，廣泛分布于自然界。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明：肺炎克雷伯氏菌可通過(guò)嬰幼兒配方乳粉和一些不經(jīng)過(guò)加熱直接食用的食品引起食物中毒，例如涼拌菜、漢堡包、蔬菜沙拉等[1-3]。國(guó)內(nèi)也有嬰幼兒配方乳粉中檢出肺炎克雷伯氏菌的報(bào)道[4-5]。此菌可引起人和多種動(dòng)物患病，近年來(lái)已成為僅次于大腸桿菌的重要的致病菌[6]。肺炎克雷伯氏菌可在全身各部位發(fā)生感染，也能引起腹瀉，特別是慢性腸炎和小兒腹瀉[7]，對(duì)于新生兒和機(jī)體免疫力低者，能引起腦膜炎、敗血癥等。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)肺炎克雷伯氏菌的檢測(cè)主要有傳統(tǒng)分離鑒定方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法，傳統(tǒng)分離鑒定以及免疫方法檢測(cè)過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且靈敏度較低。近年來(lái)，肺炎克雷伯氏菌的分子檢測(cè)方法迅速發(fā)展，基于保守序列16S rRNA或phoE基因，利用PCR技術(shù)及其相關(guān)的熒光定量PCR等分子檢測(cè)技術(shù)相繼建立[8-12]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermalamplification，LAMP）技術(shù)是2000年由日本的榮研株式會(huì)的Notomi等[13-15]開(kāi)發(fā)出來(lái)的一種新的核酸擴(kuò)增方法。其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在等溫條件（65 ℃左右）保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，具有高特異性和等溫快速擴(kuò)增的特點(diǎn)，LAMP法在檢測(cè)食源性致病菌方面具有良好地應(yīng)用前景。由于LAMP產(chǎn)物由多重復(fù)靶序列的莖環(huán)狀DNA和花椰菜狀DNA組成，瓊脂糖凝膠電泳后會(huì)呈現(xiàn)特有的階梯狀條帶，但是這種方法耗時(shí)較長(zhǎng)，且需要打開(kāi)LAMP反應(yīng)管進(jìn)行電泳操作，從而增加了污染的幾率，提高了假陽(yáng)性率。LAMP在擴(kuò)增形成大量核酸時(shí)，可產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的白色焦磷酸鎂沉淀，也可以直接通過(guò)肉眼觀(guān)察白色沉淀的存在與否判斷擴(kuò)增結(jié)果，這種方式簡(jiǎn)單方便，省略電泳過(guò)程，但反應(yīng)產(chǎn)物較少，混濁度較低時(shí)，肉眼難以察覺(jué)。近年來(lái)，相繼出現(xiàn)了用于LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的實(shí)時(shí)濁度儀[16]和實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)儀。

Lucchi等[17]利用實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)儀建立了瘧原蟲(chóng)基因的實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)方法。同年，Yamazaki等[18]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)儀，建立了檢測(cè)鑒定食源性副溶血弧菌的實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)體系。實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)儀是將LAMP擴(kuò)增反應(yīng)與熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)合起來(lái)的一種便攜式等溫設(shè)備。其利用的是熒光染料（SYBR Green Ⅰ）與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)的原理[19]，即在反應(yīng)體系內(nèi)加入SYBR Green Ⅰ，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，DNA量的不斷增加，熒光信號(hào)也隨之增強(qiáng)。利用實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)儀，通過(guò)熒光信號(hào)的不斷累積就可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)的進(jìn)程，可直觀(guān)分析目的基因的擴(kuò)增結(jié)果，儀器還可自動(dòng)顯示檢測(cè)結(jié)果（陰性或陽(yáng)性）。目前，利用實(shí)時(shí)熒光LAMP技術(shù)檢測(cè)病原菌國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，而利用該方法檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的研究國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)所用菌株詳見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌種Table1 Experimental strains

續(xù)表1

1.1.2 試劑

DNA聚合酶（Bst DNA polymerase large fragment）New England Biolab公司；EasyTaq DNApolymerase和Easy Pure Genomic DNA Kit 北京全式金生物技術(shù)有限公司；甜菜堿 美國(guó)Sigma公司；dNTPs、MgSO4及DNAMarker（50、100 bp） 大連寶生物公司；LAMP引物合成于北京華大基因研究中心。

1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)儀見(jiàn)圖1A。實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)儀能有效監(jiān)測(cè)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度的變化。實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)儀與適當(dāng)?shù)碾娔X軟件相連接，擴(kuò)增曲線(xiàn)就會(huì)被顯示出來(lái)，見(jiàn)圖1B。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，會(huì)出現(xiàn)明顯的峰圖，出峰時(shí)間越早，峰值越高，表明LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增效率越高。在一定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，根據(jù)儀器的擴(kuò)增判定標(biāo)準(zhǔn)，曲線(xiàn)斜率超過(guò)固定值30，則證明發(fā)生了LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，儀器自動(dòng)判定檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，否則判為陰性[14]。該儀器一次可同時(shí)監(jiān)測(cè)8管反應(yīng)。

圖1 實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)儀（A）和擴(kuò)增曲線(xiàn)（B）Fig.1 ESE Quant TS and amplification curves

ESE-Quant Tube Scanner實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)儀 德國(guó)ESE Gmbh公司；數(shù)顯超級(jí)恒溫水浴鍋 金堂市杰瑞爾電器有限公司；3K30高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；T Gradient PCR擴(kuò)增儀 德國(guó)Biometra公司；UVIpro凝膠成像系統(tǒng) 英國(guó)UVItec公司；DYY-10C型電泳儀北京市六一廠(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 純菌培養(yǎng)

挑取一接種環(huán)肺炎克雷伯氏菌接種于新鮮無(wú)菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h。采用稀釋平板法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，測(cè)定其純培養(yǎng)物活菌數(shù)為7.9×108CFU/mL。

1.3.2 模板DNA的制備

采用試劑盒法（Easy Pure Genomic DNA Kit）提取肺炎克雷伯氏菌基因組DNA，按照說(shuō)明書(shū)將提取的基因組DNA溶解在200 μL的洗脫緩沖液中，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA質(zhì)量濃度為40.5 ng/mL，儲(chǔ)存在－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物設(shè)計(jì)

有研究[20]表明，選擇合適的目的基因和正確的引物設(shè)計(jì)是LAMP反應(yīng)成功的關(guān)鍵。針對(duì)肺炎克雷伯氏菌GenBank中的phoE基因（A04376.1），運(yùn)用在線(xiàn)引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorerV4（http://primerexplorer.jp/ elamp4.0.0/index.html）進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)。針對(duì)6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物：2條外引物（F3和B3），2條內(nèi)引物（FIP和BIP）。FIP由F1的一個(gè)互補(bǔ)序列和正向序列F2構(gòu)成。BIP由B1的一個(gè)互補(bǔ)序列和正向序列B2構(gòu)成。擴(kuò)增基因組中的位置從266～473 bp區(qū)域207 bp目的基因片斷。引物的名稱(chēng)和具體序列見(jiàn)表2。每條引物在基因組中具體的位置如圖2所示。

表2 LAMP引物Table2 LAMP primers

圖2 引物位置Fig.2 Primer location

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)

將1.3.1節(jié)中的純菌培養(yǎng)物，用生理鹽水進(jìn)行10 倍系列稀釋?zhuān)瑫r(shí)從每稀釋度菌液中取1 mL直接用于提取肺炎克雷伯氏菌基因組DNA，做為模板。實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)經(jīng)過(guò)反復(fù)優(yōu)化，確定如下體系和反應(yīng)條件。

實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)體系：10 μmol/L FIP和BIP各4 μL，10 μmol/L F3和B3各0.5 μL，50 mmol/L MgSO40.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，5 mol/L甜菜堿1 μL，10×BstDNA聚合酶緩沖液，8 000 U/mL的Bst DNA聚合酶1、2 μL DNA模板，0.5 μL SYBR Green Ⅰ，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL反應(yīng)體系。

實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)程序：反應(yīng)溫度63 ℃，反應(yīng)時(shí)間90 min，但可根據(jù)反應(yīng)情況，隨時(shí)停止反應(yīng)。此外，取擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，與1 μL的6×loading buffer均勻混合，2%瓊脂糖凝膠電泳，觀(guān)察梯形條帶，以便證實(shí)是否發(fā)生LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。

1.3.5 PCR反應(yīng)

為了比較實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌靈敏度，進(jìn)行了PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)的引物是檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的LAMP反應(yīng)的兩條外引物（F3和B3），見(jiàn)表2。

PCR反應(yīng)體系：10×EasyTaq buffer，50 mmol/L MgSO40.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，5 U的EasyTaq DNA polymerase，2 μL的DNA模板并用滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL反應(yīng)體系。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s。進(jìn)行31 個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，與1 μL的6×loading buffer均勻混合，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀(guān)察電泳結(jié)果。

1.3.6 人工污染乳粉

在人工污染肺炎克雷伯氏菌前，乳粉按FDA推薦的常規(guī)檢驗(yàn)法證實(shí)不含肺炎克雷伯氏菌。取25 g乳 粉溶于225 mL滅菌生理鹽水中，然后將肺炎克雷伯氏菌人工污染到乳粉中：不同稀釋度的人工污染乳粉溶液中，肺炎克雷伯氏菌的濃度分別為7.9×108～7.9×100CFU/mL。同時(shí)從每種稀釋度乳粉溶液中取1 mL分別加入l mL無(wú)水乙醇、l mL氨水和l mL石油醚，混勻，以12 000 r/min離心10 min。棄去上清液，剩余的沉淀分別用1 mL 10 mmol/L TE（pH 7.8）溶解。再用試劑盒法提取溶液中肺炎克雷伯氏菌基因組DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 反應(yīng)產(chǎn)物的酶切分析

取5 μL LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，加入1 μL限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、2 μL 10×反應(yīng)緩沖液及滅菌的雙蒸水12 μL。37 ℃水浴2 h。然后加入2 μL 10×loading buffer終止酶活。進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀(guān)察電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)方法

按1.3.4節(jié)所述LAMP反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，除實(shí)驗(yàn)管外，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行電泳，證實(shí)是否發(fā)生LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3A可知，隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間接近40 min時(shí)，實(shí)驗(yàn)管和陽(yáng)性對(duì)照管熒光強(qiáng)度開(kāi)始大幅度增強(qiáng)。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到55 min左右時(shí)峰值分別達(dá)到最高。而陰性對(duì)照管，直到擴(kuò)增結(jié)束也沒(méi)有出現(xiàn)明顯的峰值。由圖3B可知，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，實(shí)驗(yàn)管和陽(yáng)性對(duì)照管電泳后，出現(xiàn)LAMP反應(yīng)典型的階梯狀條帶，而陰性對(duì)照管，未出現(xiàn)階梯狀條帶。因此，實(shí)時(shí)熒光LAMP的檢測(cè)結(jié)果和電泳檢測(cè)的結(jié)果一致，表明實(shí)驗(yàn)管和陽(yáng)性對(duì)照管確實(shí)發(fā)生了LAMP擴(kuò)增。

圖3 肺炎克雷伯氏菌結(jié)果Fig.3 Detection of Klebsiella pneumoniae

2.2 實(shí)時(shí)熒光LAMP產(chǎn)物的酶切分析結(jié)果

確定LAMP擴(kuò)增反應(yīng)特異性的最好方法就是電泳后測(cè)序，但由于LAMP反應(yīng)電泳條帶為梯形帶，給測(cè)序帶來(lái)極大的困難。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)LAMP 產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析，在一定程度上也可以達(dá)到鑒定產(chǎn)物特異性的目的。EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)位于引物B1c和B2之間。 通過(guò)理論推導(dǎo)可知，對(duì)肺炎克雷伯氏菌的實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行酶切，理論上產(chǎn)生的片段大小主要為154 bp和239 bp。 在本實(shí)驗(yàn)中，肺炎克雷伯氏菌實(shí)時(shí)熒光LAMP產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ進(jìn)行消化后，產(chǎn)生的片段大小與理論值相符，見(jiàn)圖4。

圖4 LAMP產(chǎn)物的酶切分析結(jié)果Fig.4 Enzyme digestion analysis of LAMP products

2.3 實(shí)時(shí)熒光LAMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)的特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Specificity of real-time fluorescent LAMP

對(duì)表1所列的21 株實(shí)驗(yàn)菌株分別用試劑盒法提取基因組DNA，以滅菌雙蒸水模板做為陰性對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP擴(kuò)增，以驗(yàn)證檢測(cè)方法的特異性。結(jié)果見(jiàn)圖5。只有肺炎克雷伯氏菌出現(xiàn)明顯的峰值，其他致病菌株均未出現(xiàn)，表明本研究建立的檢測(cè)方法特異性較強(qiáng)。

2.4 純菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的靈敏度

將肺炎克雷伯菌純菌培養(yǎng)物進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)M(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)，確定檢測(cè)方法的靈敏度，同時(shí)以PCR檢測(cè)為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖6和圖7。

圖6 實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Sensitivity of real-time fluorescent LAMP

由圖6可知，當(dāng)純菌培養(yǎng)物濃度為7.9×107～7.9×101CFU/mL時(shí)，實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)曲線(xiàn)出現(xiàn)明顯峰值，呈陽(yáng)性結(jié)果，儀器亦顯示陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)純菌培養(yǎng)物濃度為7.9×100CFU/mL時(shí)，反應(yīng)曲線(xiàn)平緩，未出現(xiàn)峰值，呈陰性結(jié)果，儀器亦顯示陰性結(jié)果。因此，本實(shí)驗(yàn)所建立的肺炎克雷伯氏菌實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)方法的靈敏度為79 CFU/mL。

圖7 PCR反應(yīng)的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Sensitivity of PCR

由圖7可知，當(dāng)純菌培養(yǎng)物的菌液濃度稀釋到7.9×102CFU/mL時(shí)，PCR反應(yīng)不再出現(xiàn)目的條帶，即PCR反應(yīng)的靈敏度為7.9×103CFU/mL。因此，實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)肺炎克雷伯菌的靈敏度為PCR檢測(cè)的100 倍。

2.5 人工污染檢出限的確定

原始菌液濃度為7.9×108CFU/mL，人工污染乳粉后，每個(gè)稀釋度分別提取DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖8。當(dāng)稀釋液菌濃度為7.9×100CFU/mL時(shí)，雖然曲線(xiàn)略有抬頭，但是峰值并不明顯。即使出現(xiàn)明顯的峰值，如果出峰時(shí)間晚于最早出峰時(shí)間的一倍以上，可以認(rèn)定為陰性結(jié)果。即所建立的肺炎克雷伯氏菌LAMP檢測(cè)實(shí)樣的檢出限達(dá)到79 CFU/g。

圖8 實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)人工污染乳粉的檢出限Fig.8 Detection limit of artificially contaminated milk powder by LAMP

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)肺炎克雷伯氏菌phoE基因全序列的分析，利用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，并且利用熒光染料熒光顯色的特性，通過(guò)向反應(yīng)體系中添加SYBR GreenⅠ，利用實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)儀成功地建立了檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)方法，檢測(cè)純菌的靈敏度和檢測(cè)人工污染乳粉的檢出限分別為79 CFU/mL和 79 CFU/g；與普通PCR檢測(cè)方法相比較，實(shí)時(shí)熒光LAMP方法檢測(cè)靈敏度是常規(guī)PCR的100 倍，且縮短了檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)結(jié)果直觀(guān)。因此該方法靈敏度高、耗時(shí)短、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1] PUSPANDAN S, AFSAH-HEJRI L, LOO Y Y, et al. Detection of Klebsiella pneumoniae in raw vegetables using most probable number-polymerase chain reaction (MPN-PCR)[J]. International Food Research Journal, 2012, 19(4): 1757-1762.

[2] HARYANI Y, NOORZALEHA A S, FATIMAH A B, et al. Incidence of Klebsiella pneumonia in street foods sold in Malaysia and their characterization by antibiotic resistance, plasmid profiling, and RAPDPCR analysis[J]. Breakdowns in Food Safety, 2007, 18(7): 847-853.

[3] SABOTA J M, HOPPES W L, ZIEGLER J R, et al. A new variant of food poisoning: enteroinvasive Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli sepsis from a contaminated hamburger[J]. The American Journal of Gastroenterology, 1998, 93(1): 118-119.

[4] 盧雁, 王瑤, 于寧. 嬰兒配方粉中克雷伯氏菌的檢出及污染情況[J].中國(guó)乳品工業(yè), 2011, 39(3): 56-58.

[5] 高建新, 盧兆蕓, 涂俊凌, 等. 嬰幼兒配方乳粉中檢出肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種的報(bào)告[J]. 2009, 25(6): 611-612.

[6] TORABI R, CHARNOVA S, ABELLAR R G, et al. Intrauterine infection with Klebsiella pneumoniae: report of a case and literature review[J]. Pediatr Dev Pathol, 2008, 11(2): 152-155.

[7] 賈艷, 孫長(zhǎng)江, 韓文瑜. 肺炎克雷伯菌研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)雜志, 2009, 26(5): 75-78.

[8] 李挺, 張麗芳, 劉星, 等. 肺炎克雷伯氏菌特異性抗原的篩選與鑒定[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 20(7): 21-26.

[9] 秦麗, 周正, 穆燕魁, 等. PCR檢測(cè)乳粉中肺炎克雷伯氏菌[J]. 河北師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 35(2): 192-196.

[10] 楊春華, 曹際娟, 鐘毅. 乳及乳制品中肺炎克雷伯氏菌 PCR-DHPLC檢測(cè)新技術(shù)的建立[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2010, 37(12): 1805-1810.

[11] SUN Feilong, JIN Min, QIU Zhigang, et al. Construction and evaluation of reference standards for detection and quantification of Klebsiella pneumoniae using real-time PCR[J]. Academic Journal of Xi’an Jiaotong University, 2010, 22(3): 183-187.

[12] LIU Yin, LIU Chao, ZHENG Wenjie, et al. PCR detection of Klebsiella pneumoniae in infant formula based on 16S-23S internal transcribed spacer[J]. International Jouranal of Food Microbiology, 2008, 125(3): 230-235.

[13] NOTOMI T, OKAYAMA H, MASUBUCHI H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Research, 2000, 28(12): e63.

[14] 匡燕云, 李思光, 羅玉萍. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增核酸技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2007, 34(3): 557-560.

[15] MORI Y, NAGAMINE K, TOMITA N, et al. Detection of loopmediated isothermal amplification reaction by turb idity derived from magnesium pyrophosphate formation[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001, 289(1): 150-154.

[16] MORI Y, KITAO M, TOMITA N, et al. Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2004, 59(2): 145-157.

[17] LUCCHI N W, DEMAS A, NARAYANAN J, et al. Real-time fluorescence loop mediated isothermal amplification for the diagnosis of malaria[J]. PLoS ONE, 2010, 5(10): e13733.

[18] YAMAZAKI W, KUMEDA Y, MISAWA N, et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of the tdh and trh genes of Vibrio parahaemolyticus and related Vibrio species[J]. Appliedand Environmental Microbiology, 2010, 76(3): 820-828.

[19] SMITH C J, OSBORN A M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2009, 67(1): 6-20.

[20] YE J, COULOURIS G, ZARETSKAYA I, et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction[J]. BMC Bioinformatics, 2012, 13: 134.

Detection of Klebsiella pneumoniae in Milk Powder by Real-Time Fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification Method

CHEN Wen-xiu, JIANG Xuan, MA Xiao-yan, ZHANG Wei*
(College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, China)

Klebsiella pneumoniae which can cause diseases such as pneumonia was identified as a new foodborne pathogenic bacterium in recent years. Using an ESE-Quant tube scanner, a new real-time fluorescent loop-mediated isothermal amplification method for detecting K. pneumoniae was established with the primers designed based on the phoE gene sequence published in GenBank. The results showed that this method had high specificity and sensitivity than PCR method. Among 21 tested strains, 4 were identified as K. pneumoniae, and the other 17 were negative. The detection limit of K. pneumoniae in artificially contaminated milk powder was 79 CFU/g, 100 times more sensitive than the conventional PCR method. Moreover, the positive results could be directly identified immediately through the data and chart collected by the ESE-Quant tube scanner so that real-time results could be provided.

Klebsiella pneumoniae; phoE gene; real-time fluorescence LAMP; detection; SYBR Green Ⅰ

TS207.4

A

1002-6630（2014）20-0192-06

10.7506/spkx1002-6630-201420038

2013-11-21

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2008000216）

陳文秀（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橛泻ξ⑸餀z測(cè)與控制。E-mail：chenwenxiu1989@126.com

*通信作者：張偉（1963—），男，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称凡≡鷻z測(cè)技術(shù)。E-mail：zhangwei631126@163.com