許 鳳，王長遠,2,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

響應面法優(yōu)化物理輔助堿法提取米糠蛋白工藝

許 鳳1，王長遠1,2,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

比較分析堿法、膠體磨輔助堿法、超聲輔助堿法、膠體磨超聲輔助堿法對米糠蛋白提取率及純度的影響。結(jié)果表明，膠體磨超聲輔助堿法能夠顯著提高米糠蛋白的提取率，其純度為74.27%。并以此方法中的超聲功率、液料比、超聲溫度、超聲時間為考察因素，蛋白提取率為響應值。通過Design Expert 8.0.6軟件做響應面優(yōu)化分析得，膠體磨超聲提取米糠蛋白的最佳工藝為米糠粒徑40目、pH 9、超聲功率69 W、工作時間4 s、間歇時間2 s、液料比20∶1（mL/g）、超聲時間40 min、超聲溫度46 ℃，此條件下模型預測蛋白提取率為92.14%。經(jīng)驗證，實際提取率為90.84%，與模型相符。膠體磨超聲輔助堿法能夠顯著地提高米糠蛋白的提取率，且時間短，為米糠蛋白的進一步研究提供參考。

米糠蛋白；物理輔助堿法；提取率；響應面分析

目前，許多學者將不同來源的植物蛋白添加到食品中，以較低的成本來提高食品的營養(yǎng)價值[1-3]。米糠是碾米過程中的副產(chǎn)品，含12%～15%的粗蛋白[4]，蛋白質(zhì)的消化率大于90%，氨基酸模式優(yōu)于大豆蛋白和酪蛋白，含有豐富的賴氨酸（3%～4%），并且具有低過敏性，特別適合開發(fā)嬰幼兒配方食品[5]。

但由于米糠蛋白的高聚合活性和蛋白中含有的二硫鍵使米糠蛋白的溶解性較差。此外米糠蛋白中含有肌醇六磷酸和纖維與蛋白質(zhì)聚合，使米糠蛋白的分離較困難[6]。目前，提取米糠蛋白的方法主要有堿法提取、酶法提取和物理法提取。堿法提取時蛋白質(zhì)暴露在強堿條件可能改變其營養(yǎng)特性，如半胱氨酸和絲氨酸殘基轉(zhuǎn)變成有毒性的賴氨酸和丙氨酸[7]；目前使用最多的是酶法提取，以蛋白酶為主，要保持米糠蛋白的良好營養(yǎng)性和功能性，需控制較低的水解度，而水解度低，又往往沒有高的提取率[8]。并且蛋白酶將米糠蛋白水解破壞了其完整的結(jié)構，影響了對米糠蛋白結(jié)構的深入研究。目前，超聲、高速混勻和凍融等物理方法已用于提取米糠蛋白，物理處理不易引起米糠蛋白的變性，在食品加工中比堿法和酶法更適于應用[9]。

超聲和勻漿技術通常被認為是安全、無毒、環(huán)保的，對于食品行業(yè)，這使得超聲優(yōu)于其他技術而被廣泛應用。超聲輔助提取是利用超聲波增大物質(zhì)分子運動頻率和速度，增加溶劑的穿透力，提高藥物溶出度，縮短提取時間的浸提方法。國內(nèi)外已有人將超聲波技術用于蛋白質(zhì)的提取[10-12]。本研究擬采用膠體磨與超聲結(jié)合輔助堿法提取米糠蛋白，通過響應面分析對超聲條件進行了優(yōu)化，確定最佳提取方案，以期提高米糠蛋白的提取率，縮短提取時間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂米糠由黑龍江省農(nóng)墾總局查哈陽農(nóng)場提供，水稻品種為空育131。

正己烷、濃H2SO4、CuSO4、K2SO4、鹽酸、Folin-酚試劑乙液、酒石酸甲鈉、牛血清白蛋白、碳酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉（均為分析純） 天津市博迪化工有限公司。

1.2 儀器與設備

DK-S12型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司；pHS-3C精密pH計 上海虹益儀器儀表有限公司；VC×150超聲波破碎儀 北京中科科爾儀器有限公司；TDZ5-WS臺式低速離心機 湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠原料的篩選

分別選用40、60、80、100 目的標準篩篩分米糠，獲得4 種不同顆粒大小的米糠樣品。用微量凱氏定氮法測定不同顆粒大小的米糠中蛋白質(zhì)含量，并用常規(guī)堿法提取不同目數(shù)篩分的蛋白。

1.3.2 脫脂米糠的制備

參照Sze-tao等[13]方法并略作改動。按料液比1∶5（g/mL）加入正己烷磁力攪拌3 h，在浸提過程中更換正己烷3～4 次，混合料液于4 000 r/min離心15 min，沉淀攤勻于通風櫥中揮發(fā)剩余溶劑，上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正己烷。

1.3.3 米糠營養(yǎng)成分的測定

蛋白質(zhì)測定：參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)含量的測定》的凱氏定氮法；脂肪測定：參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》的索氏抽提法；水分測定：參照GB/T 20264—2006《糧食、油料水分兩次烘干測定法》；灰分測定：參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》于600 ℃灰化法。

1.3.4 膠體磨處理

將脫脂米糠以1∶10（g/mL）的料液比在室溫條件下與蒸餾水混合，將混合料液在JMS-8D膠體磨下以恒速流通20 min。

1.3.5 米糠蛋白提取的工藝流程[8]

脫脂米糠→加入一定比例的蒸餾水→調(diào)節(jié)pH 9→超聲（保持pH值保持不變）→離心（4 000 r/min離心15 min）收集上清液→調(diào)pH 4.5（4 000 r/min離心15 min）→沉淀冷凍干燥→米糠蛋白干粉

1.3.6 單因素試驗

以超聲時間、超聲功率、液料比和超聲提取溫度進行單因素試驗，提取液4 000 r/min離心15 min，記錄上清液體積并用福林酚法測定提取液中蛋白質(zhì)濃度，計算提取率。

1.3.7 響應面分析試驗

在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理[14]，以超聲功率（X1）、液料比（X2）、超聲溫度（X3）、超聲時間（X4）4 個因素為自變量，米糠蛋白的提取率（Y）為響應值，設計了四因素五水平共31 個試驗點的響應面分析試驗，其中24 個為析因試驗，7 個為中心試驗。利用Design Expert 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)擬合，因素和水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平編碼表Table1 Coded levels for factors used in quadratic regression rotational combinational design

1.3.8 提取率的計算

采用福林酚法[15]測定上清液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠過篩目數(shù)的選擇

由于生產(chǎn)環(huán)境或人為因素使米糠中摻雜少量雜質(zhì)，會影響蛋白的提取效果[16]。分析40、60、80、100 目4 種樣品的蛋白提取率和蛋白含量，結(jié)果見表2。

由表2可知，粒度為60 目米糠的蛋白含量和提取率最高，但40 目篩的米糠原料利用率較高，且相同質(zhì)量的米糠提取的蛋白的量明顯高于60、80 目和100 目篩。這是因為篩子目數(shù)過大，即物料直徑減小，篩分米糠中淀粉含量較高，提取時容易形糊狀，影響了蛋白的溶出。在實際生產(chǎn)中，以最終所得蛋白的產(chǎn)量為首要參考，綜合考慮，選用過40 目篩的米糠為后續(xù)實驗原料。

表2 不同粒徑米糠的蛋白含量及提取率Table2 Protein contents and extraction rates of rice bran powders with particle sizes

2.2 米糠的營養(yǎng)成分

由表3可知，新鮮米糠中脂肪含量為26.7%，經(jīng)正己烷脫脂后的米糠脂肪含量為5.92%，脫脂率為77.83%，說明正己烷有較好的脫脂效果。脫脂后米糠蛋白質(zhì)含量高達15.76%，高于精白米本身的蛋白質(zhì)含量（6%～10%）[17]，米糠是大米加工的副產(chǎn)品，是良好的植物蛋白資源，具有很大的開發(fā)潛力。

2.3 提取方法的比較

選擇不同的方法提取米糠蛋白，以蛋白純度和提取率為評價指標，結(jié)果如表4所示。

表4 不同提取方法對米糠蛋白提取率的影響Table4 Effect of extraction methods on the extraction rate of rice bran protein

由表4可知，常規(guī)堿液提?。╬H 9）所得蛋白質(zhì)提取率最低，經(jīng)膠體磨處理后，蛋白提取率從59.43%增加到64.17%，蛋白純度未見明顯變化，與文獻[18-19]的研究結(jié)果一致；進一步超聲處理，提取率達到83.53%，純度由71.87%增加到74.27%，蔡路昀等[20]的研究也表明超聲輔助法能夠顯著地提高蛋白質(zhì)的提取率。膠體磨使米糠混合液處于高水平機械剪切狀態(tài)，減小了樣品的粒徑，使蛋白更容易被提取出來；而超聲波在液體中的空穴作用增加了細胞內(nèi)容物穿透能力，加速蛋白質(zhì)的擴散溶出[21-22]，并且打破了蛋白質(zhì)與其他非蛋白成分的結(jié)合和交聯(lián)，進而使沉淀所得蛋白純度提高。因此，膠體磨與超聲協(xié)同輔助堿法能夠顯著地提高米糠蛋白的提取率（P＜0.05）。

2.4 米糠蛋白超聲提取單因素試驗

對膠體磨超聲輔助堿法提取米糠蛋白進行單因素試驗，在提取過程中pH值控制在9左右，超聲時間4 s、間歇時間2 s。

2.4.1 超聲溫度對米糠蛋白提取率的影響

按液料比10∶1加入蒸餾水、超聲功率80 W、超聲時間20 min的條件下進行提取，溫度對米糠蛋白提取率的影響如圖1所示。

圖1 超聲溫度對米糠蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the extraction rate of rice bran protein

由圖1可以看出，當提取溫度從25 ℃升至45 ℃，提取率顯著增加（P＜0.05），隨著溫度繼續(xù)升高，蛋白提取率有緩慢下降的趨勢。這可能是因為溫度低于45 ℃時，分子的擴散速度慢，物料的空化作用不充分，從而降低了提取率；而由于溫度和超聲過程中產(chǎn)生的熱效應共同作用使溫度過高，引起物料糊化和蛋白質(zhì)變性[20]，使蛋白形成大分子聚集體，從而降低了蛋白的提取率。同時考慮到高溫需要投入較高的能耗，因此超聲溫度選擇45 ℃。

2.4.2 超聲功率對米糠蛋白提取率的影響

在液料比10∶1、超聲時間20 min、超聲溫度45 ℃的條件下，考察超聲功率對米糠蛋白提取率的影響。

圖2 超聲功率對米糠蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of rice bran protein

由圖2可知，當超聲功率小于60 W時，米糠蛋白提取率隨功率的增大而增大（P＜0.05）。這是因為超聲波可直接作用于分子，當功率增大時，分子的運動加劇，可快速破壞細胞壁，使蛋白更快的被分離提取出來[23]，當超聲功率大于60 W時，蛋白提取率略有下降并趨于平緩。分析原因，可能是功率較大時，超聲強度過大使空化起泡沒有足夠的時間破裂，空化效率降低，提取率下降。因此選用的超聲功率為60 W。

2.4.3 超聲時間對米糠蛋白提取率的影響

在液料比10∶1、超聲功率80 W、超聲溫度45 ℃的條件下，考察超聲時間對米糠蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲時間對米糠蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction rate of rice bran protein

由圖3可知，超聲時間對米糠蛋白的提取率影響較大，在提取 5～30 min內(nèi)，隨著時間的延長，物料不斷地膨脹并且破碎度不斷增加，使米糠蛋白較快的溶出；但在30 min后，蛋白提取率反而下降，可能是超聲的時間過長，細胞內(nèi)降解蛋白的酶也隨著溶出，破壞了蛋白的結(jié)構，使提取率降低[24]。同時考慮到合理的生產(chǎn)周期，超聲時間定為30 min。

2.4.4 液料比對米糠蛋白提取率的影響

液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，超聲功率80 W、超聲時間20 min、超聲溫度45 ℃的條件下進行提取，測定最終提取液中蛋白質(zhì)含量，并計算提取率，結(jié)果見圖4。

圖4 液料比對米糠蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-to-material ratio on the extraction rate of rice bran protein

由圖4可以看出，隨著液料比的增大，米糠蛋白的提取率逐漸增大并趨于平穩(wěn)。這是因為在液料比較低時，提取液的黏度較高，產(chǎn)生較高的超聲空化作用，致使超聲所需的壓力增大，空化閥也增大，影響分子的擴散速率，使得體系分散不均勻，導致提取效果不理想；但料水比過大，不僅浪費資源，也會為后面的濃縮工作帶來困難。綜合考慮，液料比為15∶1最合適。

2.5 響應面法優(yōu)化膠體磨超聲輔助提取米糠蛋白的工藝參數(shù)

2.5.1 模型的建立及顯著性檢驗

通過軟件對表5中的數(shù)據(jù)進行二次多遠回歸擬合，得到米糠蛋白提取率Y對X1、X2、X3和X4的二次多項回歸方程為：

表5 響應面分析方案與試驗結(jié)果Table5 Experimental design and results for response surface analysis

方程中各因素系數(shù)絕對值大小反映各因素對響應值的影響程度，系數(shù)的正、負反映影響的方向[25]。因為方程的二次項系數(shù)是負值，代表3D圖形的拋物面開口向下，具有極大值點，可以進行優(yōu)化分析[26]。對該模型進行顯著性分析，結(jié)果見表6。由表6可知，模型顯著性檢驗P＜0.01，R2=0.988 1，R2Adj=0.977 7，只有1.04%的誤差，說明該方程的擬合度和可信度都很高；失擬項不顯著（P=0.521 3），說明回歸方程擬合充分，可以用該模型對膠體磨超聲輔助法提取米糠蛋白的工藝進行分析和預測。

表6 回歸模型方差分析Table6 Analysis of variance for the regression model

2.5.2 響應面分析與優(yōu)化

橢圓圖形的中心區(qū)域，蛋白提取率最高，橢圓排列越密集，說明因素變化對蛋白提取率影響較大。結(jié)果顯示，每個因素對米糠蛋白提取率的影響都達到了極顯著水平（P＜0.01），4 個因素影響大小順序依次是X4＞X2＞X1＞X3；因素X1X2、X3X4、X2X4、X2X3的P＜0.05，說明因素間有顯著的交互作用；X1X3、X1X4的P＞0.05，表明功率與溫度、功率與時間沒有顯著的交互作用，圖5為交互作用顯著的三維圖形及等高線圖。

圖5 各因素交互作用對蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of extraction parameters on the extraction rate of rice bran protein

2.5.3 最佳工藝參數(shù)

由該模型得到最優(yōu)水平為超聲功率68.65 W、液料比20∶1、超聲時間40 min、超聲溫度45.90 ℃。在此條件下米糠蛋白提取率為92.14%。從實際條件分析，選定的最優(yōu)參數(shù)是：超聲功率69 W、液料比20∶1、超聲時間40 min、超聲溫度46 ℃。在此條件下蛋白提取率進行3 次平行驗證實驗。蛋白提取率實際平均值為90.84%，相對誤差為1.3%，與理論結(jié)果基本相符。經(jīng)凱氏定氮法對最優(yōu)條件下所得米糠含量進行測定，蛋白含量為73.31%。研究表明膠體磨超聲輔助法能夠顯著地提高米糠蛋白的提取率，這種方法是切實可行的。

3 結(jié) 論

比較不同目數(shù)篩子對米糠蛋白提取率及純度的影響，結(jié)果表明，米糠過40 目篩能夠除去大部分雜質(zhì)，使蛋白提取率和米糠的有效利用率達到最高；膠體磨超聲輔助堿法能夠顯著地提高米糠蛋白的提取率，蛋白純度為74.27%。

通過Design Expert 8.0.6 軟件做響應面優(yōu)化分析得膠體磨超聲提取米糠蛋白的最佳工藝為超聲功率69 W、液料比20∶1、超聲時間40 min、超聲溫度46 ℃。在此條件下蛋白提取率進行3 次平行驗證實驗。蛋白提取率實際平均值為90.84%，相對誤差為1.3%，與理論結(jié)果基本相符。表明膠體磨超聲輔助法能夠顯著地提高米糠蛋白的提取率，這種方法是切實可行的。膠體磨超聲輔助堿法所得米糠蛋白提取率高、時間短，為米糠蛋白的進一步研究提供理論依據(jù)。

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Optimization of Physical Force-Assisted Alkaline Extraction of Rice Bran Protein

XU Feng1, WANG Chang-yuan1,2,*
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

This study comparatively evaluated the efficiencies of alkaline extraction, colloid milling-assisted alkaline extraction, ultrasonic-assisted alkaline extraction, and colloid milling, ultrasonic-assisted extraction for the extraction of rice bran protein (RBP) with respect to RBP yield and purity. It was shown that a significantly increased extraction yield and a RBP purity of 74.27% were obtained by the colloid milling, ultrasonic-assisted extraction method. In this method, the extraction parameters ultrasonic power, solid-to-solvent ratio, temperature and extraction time were optimized by response surface methodology using the Design Expert 8.0.6. The optimum extraction conditions for maximizing RBP yield were determined as 40 mesh, 9, 69 W, 4 s, 2 s, 20:1 (mL/g), 40 min and 46 ℃ for rice bran granularity, pH, ultrasonic power, working time, intermittent time, solid-to-solvent ratio, ultrasonication time and extraction temperature, respectively. The predicted extraction yield of RBP was 92.14%, agreeing with the experimental value (90.84%). The colloid milling, ultrasonic-assisted extraction method could significantly increase the extraction yield of RBP and shorten the extraction time and thus could provide a foundation for for further study of rice bran protein.

rice bran protein; physical force-assisted alkaline extraction; extraction yield; response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630（2014）20-0011-06

10.7506/spkx1002-6630-201420003

2013-11-12

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101387）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD34B00）；黑龍江省教育廳科學技術項目（12531446）

許鳳（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：xufeng890727@163.com

*通信作者：王長遠（1976—），男，副教授，博士，研究方向為食品科學、糧油及植物蛋白。E-mail：byndwcy@163.com