葉日貴，高 杰，王 冰，李二虎，張 燕，江 飛，曹 瑞，服部征雄，王世明，馬超美,*

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.日本富山大學(xué)和漢醫(yī)藥學(xué)綜合研究所，日本 富山 2630 930-0194；3.內(nèi)蒙古鄂爾多斯藍(lán)原中藥材有限公司，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 150600）

超高效液相-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定并比較甘草各部位中8 種成分含量

葉日貴1，高 杰1，王 冰1，李二虎1，張 燕1，江 飛1，曹 瑞1，服部征雄2，王世明3，馬超美1,*

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.日本富山大學(xué)和漢醫(yī)藥學(xué)綜合研究所，日本 富山 2630 930-0194；3.內(nèi)蒙古鄂爾多斯藍(lán)原中藥材有限公司，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 150600）

建立同時(shí)檢測(cè)甘草中8 種成分：22-羥基-甘草次酸、3-epi-甘草次酸、甘草次酸、甘草酸、甘草苷、芒柄花黃素、異甘草酚、甘草香豆素的超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法。選用膽酸作為三萜成分的內(nèi)標(biāo)，相思子素2”-O-β-芹菜糖苷作為酚類化合物的內(nèi)標(biāo)。甘草樣品經(jīng)粉碎用甲醇（含內(nèi)標(biāo)液）超聲提取，采用安捷倫ZORBAX RRHD C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），以甲醇-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，以電噴霧電離源，采用超高效液相-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定。結(jié)果表明，8 種成分檢出限均小于0.048 8 μg/mL，定量限均小于0.195 2 μg/mL，在0.048 8～12.500 0、0.048 8～12.500 0、0.012 2～12.500 0、0.048 8～50.000 0、0.048 8～50.000 0、0.012 2～12.500 0、0.012 2～15.000 0、0.195 2～12.500 0 μg/mL范圍內(nèi)，22-羥基-甘草次酸、3-epi-甘草次酸、甘草次酸、甘草酸、甘草苷、芒柄花黃素、異甘草酚、甘草香豆素的峰面積與質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；方法回收率為97.2%～113.0%間；其日內(nèi)及日間精密度實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 2.63%～4.47%及1.75%～3.72%。該方法靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，可用于甘草各部位及其相關(guān)食品質(zhì)量控制。

甘草；甘草各部位；超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用；同時(shí)測(cè)定

甘草（Radix Glycyrrhizae）又稱“蜜甘”、“蜜草”[1]，是豆科甘草屬多年生植物甘草的根和根莖，主要含黃酮類、三萜類、香豆素類、生物堿、皂苷類、甾醇、揮發(fā)油、有機(jī)酸及其他多種成分，具抗氧化[2-5]、抗腫瘤[6-9]、抗菌和增強(qiáng)免疫力[10-13]、抗肝癌保肝[14-16]、促進(jìn)胰泌素分泌[17]等一系列生物活性，是公認(rèn)的常用大宗藥草，在中醫(yī)藥領(lǐng)域被譽(yù)為“國老”。甘草還是一種良好的天然甜味劑，其甜度是蔗糖的50 倍，在食品工業(yè)上有廣泛應(yīng)用。此外，還應(yīng)用于畜牧業(yè)，煙草及化妝品工業(yè)[18-19]。

目前，常用于甘草有效成分定量檢測(cè)的方法有比色法、薄層掃描法、紫外分光光度法及高效液相色譜法等[20-22]，上述方法在甘草及其產(chǎn)品的質(zhì)量控制方面發(fā)揮了重要作用，然而到目前為止，還沒有可以同時(shí)分析所有主要甘草成分的理想方法[23]。現(xiàn)代新型分析儀器如超高效液相能顯著提高分辨率并縮短測(cè)定時(shí)間，質(zhì)譜檢測(cè)器特別是其多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式能夠大幅提高檢測(cè)靈敏度和特異性，優(yōu)化的內(nèi)標(biāo)測(cè)定法還能補(bǔ)償回收率不佳等問題，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在食品功能成分及有害物質(zhì)殘留的檢測(cè)方面發(fā)揮了越來越重要的作用[24]。本實(shí)驗(yàn)采用了超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（ultra-high-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-QQQMS）儀，從甘草成分中選取黃酮類、三萜類及香豆素類3 類化合物共8 種化合物（22-羥基-甘草次酸、3-epi-甘草次酸、甘草次酸、甘草酸、甘草苷、芒柄花黃素、異甘草酚、甘草香豆素）作為待測(cè)化合物，以膽酸和相思子素2”-O-β-芹菜糖苷作為三萜和酚類化合物的內(nèi)標(biāo)，對(duì)甘草根、根莖過渡區(qū)、甘草地上部分（莖、葉、種子、種皮）及5 種添加有甘草的相關(guān)食品進(jìn)行了待測(cè)化合物含量的同時(shí)測(cè)定，并對(duì)各類化合物的分布情況進(jìn)行了比較分析，為甘草藥材、成藥及相關(guān)食品質(zhì)量控制提供新的方法，并為甘草地上部分開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘草藥材于2010年10月19日采于內(nèi)蒙古鄂爾多斯杭錦旗呼和木都蘇木，為3～4 a生野生人工撫育甘草。5 種添加甘草的相關(guān)食品：桃肉蜜餞、葡萄蜜餞 廣州市國王食品有限公司；甘草杏 蘭州頂呱呱食品有限公司；甘草良咽糖 內(nèi)蒙古億利科技實(shí)業(yè)股份有限公司；瓜子內(nèi)蒙古真心食品有限公司。

8 種標(biāo)準(zhǔn)品及兩種內(nèi)標(biāo)品均由服部征雄教授實(shí)驗(yàn)室分離提?。℉PLC檢測(cè)純度≥98%），結(jié)構(gòu)式如圖1所示。甲醇（分析純） 天津市登科化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純） 美國Fisher Scientific公司；甲酸 阿法埃莎（中國）化學(xué)有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 日本和光公司；屈臣氏蒸餾水廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

圖1 8種標(biāo)準(zhǔn)品及兩種內(nèi)標(biāo)（膽酸、相思子素2”-O-β-芹菜糖苷）的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of eight standards and two internal standards (cholic acid and abrusin 2”-O-β-apioside)

1.2 儀器與設(shè)備

1290高效液相色譜-高分辨串聯(lián)6430四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧電離源） 安捷倫科技公司；PS-20超聲波清洗儀 潔康超聲波設(shè)備有限公司；高速離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；旋渦振蕩器 其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平 丹佛儀器（北京）有限公司；粉碎機(jī) 北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司；移液槍、有機(jī)相微孔濾膜。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

安捷倫ZORBAX RRHD C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇（色譜純）。流動(dòng)相A、B的梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫條件Table1 Program of gradient elution

1.3.2 質(zhì)譜條件

UPLC-QQQMS 接有電噴霧離子源，采用正/負(fù)離子化模式；噴霧電壓4 500 V；干燥氣體氮?dú)?；干燥氣流?1 L/min；干燥氣體溫度350 ℃；毛細(xì)管電壓：正離子4 000 V；負(fù)離子3 500 V；采用選擇離子監(jiān)控模式優(yōu)化待測(cè)化合物電壓，子離子掃描模式：優(yōu)化子離子、定性離子及二者碰撞能量，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式優(yōu)化各組分分離洗脫條件，最后采用動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式高選擇性地分析測(cè)定各組分。10 種分析物質(zhì)譜條件見表2。

表2 質(zhì)譜條件優(yōu)化Table2 Optimized mass spectrometry conditions

1.3.3 溶液配制

8 種標(biāo)準(zhǔn)品各稱取適量于1.5 mL離心管中，DMSO溶解過濾，配制成0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)液；膽酸與相思子素2”-O-β-芹菜糖苷分別稱取適量于1.5 mL離心管中，DMSO溶解過濾配制成10 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液儲(chǔ)液。

1.3.4 樣品前處理

2010年10月19日，鄂爾多斯杭錦旗呼和木都蘇木當(dāng)?shù)馗什莶墒諘r(shí)節(jié)，隨機(jī)采取3～4 a生野生人工撫育甘草完整植株3 株，編為A、B、C。將每一株按其根、根莖過渡區(qū)、莖3 部分進(jìn)行分段，根部再等距分為3 份，分別編號(hào)（如：A株：A1為莖，A2為根莖過渡區(qū)，A3～5為根）。并收集同一批甘草的干燥葉子（Y）、種子（ZZ）和種皮（ZP）。葉子直接捏碎成粉末，甘草其余部分則用粉碎機(jī)粉碎，桃肉蜜餞、葡萄蜜餞及甘草杏果肉分別剪碎至小塊，真心瓜子則按其瓜子皮及瓜子仁分別剪碎至小塊，甘草良咽糖則敲碎至粉末。各樣品稱取約50 mg，分別置于2 mL離心管中，用50 μg/mL內(nèi)標(biāo)甲醇溶液超聲波提取，1 073×g離心，取上清液，有機(jī)相微孔濾膜過濾后進(jìn)樣供液相色譜-質(zhì)譜儀檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC- MS-MS條件優(yōu)化

8 種標(biāo)準(zhǔn)品及兩個(gè)內(nèi)標(biāo)通過UPLC梯度洗脫在14 min內(nèi)得到完全分離，各化合物色譜洗脫保留時(shí)間分別為：22-羥基-甘草次酸，6.995 min；3-epi-甘草次酸，10.215 min；甘草次酸，9.229 min；甘草酸，7.225 min；甘草苷，1.228 min；芒柄花黃素，4.885 min；異甘草酚，7.988 min；甘草香豆素，6.774 min；膽酸，8.269 min；相思子素2”-O-β-芹菜糖苷，1.837 min。在質(zhì)譜動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下檢測(cè)到10 種化合物分離掃描圖（圖2）。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品的動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描圖Fig.2 UPLC-QQQMS profile of standard compounds in a dynamic multiple reaction mode

2.2 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

表3 各對(duì)照品的線性關(guān)系Taable 3 Linear relationships of reference substances

標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)液各分別吸取20 μL，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至200 μL，即得混合標(biāo)準(zhǔn)品使用液，并按1∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶4比例梯度稀釋，制得8 份混合標(biāo)準(zhǔn)品使用液（每一稀釋梯度內(nèi)標(biāo)溶液濃度保持50 μg/mL）。采用所優(yōu)化的質(zhì)譜條件與色譜條件，進(jìn)樣檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液（質(zhì)量濃度范圍為0.003 1～50.000 0 μg/mL）。用Agilent Mass Hunter定量分析軟件對(duì)UPLC-QQQMS檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，待測(cè)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。取信噪比RSN=3的待測(cè)物質(zhì)量濃度為方法檢出限，取信噪比RSN=10的待測(cè)物質(zhì)量濃度為方法定量限。結(jié)果（表3）表明，8 種標(biāo)準(zhǔn)品在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性，檢出限均小于0.048 8 μg/mL，定量限均小于0.195 2 μg/mL可滿足實(shí)際檢測(cè)的需要。

2.3 樣品分析

表4 甘草各部位成分含量分析結(jié)果Table4 Contents of 8 components in different parts of Glycyrrhiza uralensis

采用Agilent Mass Hunter定量分析軟件對(duì)樣品UPLCQQQMS檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算得到待測(cè)物的質(zhì)量濃度，從而換算出待測(cè)物在樣品中的含量，結(jié)果見表4、5。

從甘草各部位定量結(jié)果（表4）可知，所測(cè)8 種標(biāo)準(zhǔn)品中三萜類成分最多，黃酮與香豆素類成分含量相仿。甘草酸、22-羥基-甘草次酸、3-epi-甘草次酸、甘草次酸是三萜類化合物。通過對(duì)定量結(jié)果分析可知，甘草酸在甘草各部位均有分布，也是被測(cè)8 種化合物中含量最多的一種。在各部位中，根莖過渡區(qū)含量最高其次為根，而且在種皮中的含量比葉子、種子及莖等部位的含量要高出很多。而對(duì)于22-羥基-甘草次酸的定量結(jié)果表明，除了在第一株甘草莖中有少量分布外其余兩株及其他部位中未能定量到此類成分。3-epi-甘草次酸、甘草次酸是相對(duì)分子質(zhì)量相同，3位羥基構(gòu)型不同的兩個(gè)化合物，在甘草各部分提取物中，二者分布相仿且含量較少。8 種標(biāo)準(zhǔn)品中甘草苷、芒柄花黃素是兩個(gè)黃酮類化合物，在甘草各部位中有著不同程度的分布，在根部含量最多。此外甘草苷在種子與種皮中也有少量的分布。甘草香豆素與異甘草酚是兩個(gè)香豆素類化合物。從對(duì)甘草各部位的定量結(jié)果可知，這兩種化合物在莖中均無分布。除此之外，甘草香豆素在種皮及葉子中的分布相當(dāng)可觀。分析結(jié)果表明，甘草各部位中待測(cè)8 種成分含量分布是不同的，有些成分并非只分布于甘草藥材常用的地下部分，葉子、種子、種皮、莖等部位中也有分布，就甘草香豆素而言，在種皮及葉子中含量豐富，接近于甘草根中的含量。這對(duì)甘草地上部分資源在藥材、食品及獸藥等領(lǐng)域的開發(fā)利用，為提高甘草資源的利用率提供重要參考依據(jù)。

表5 5 種添加甘草的食品中8 種甘草成分的定量分析結(jié)果Table5 Quantitative results of processed foods containing licorice

對(duì)添加甘草的5種相關(guān)食品的定量分析結(jié)果（表5）可知，該UPLC-QQQMS方法可對(duì)桃肉蜜餞、葡萄蜜餞、甘草良咽糖、干草杏、真心瓜子食品中甘草酸及3-epi-甘草次酸的含量進(jìn)行定量分析。其定量結(jié)果為：桃肉蜜餞、葡萄蜜餞含少量3-epi-甘草次酸，甘草良咽糖含較高量的甘草酸及少量3-epi-甘草次酸，干草杏、真心瓜子皮則含一定的甘草酸而真心瓜子仁中未檢測(cè)有甘草酸。這一分析結(jié)果證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)所建立的方法可有效地檢測(cè)添加甘草相關(guān)食品中的一些成分，并為其質(zhì)量控制方面提供參考依據(jù)。

2.4 回收率和精密度

取3 份已知質(zhì)量濃度的溶液，分別向其加入等體積高、中、低3 種已知質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，充分混勻后進(jìn)樣測(cè)定計(jì)算加樣回收率。結(jié)果22-羥基-甘草次酸、3-epi-甘草次酸、甘草次酸、甘草酸、甘草苷、芒柄花黃素、異甘草酚、甘草香豆素回收率分別為103.5%、106.4%、107.1%、97.2%、105.2%、97.3%、113.0%、109.4%。

配制質(zhì)量濃度為12.500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合液室溫放置，24 h內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6 次測(cè)定日內(nèi)精密度，日間精密度則連續(xù)3 d每天進(jìn)樣測(cè)定1 次。結(jié)果表明，在混合標(biāo)準(zhǔn)品液中22-羥基-甘草次酸、3-epi-甘草次酸、甘草次酸、甘草酸、甘草苷、芒柄花黃素、異甘草酚、甘草香豆素具有良好的精密度，其日內(nèi)及日間精密度（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）范圍分別為2.63%～4.47%和1.75%～3.72%。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立的UPLC-QQQMS內(nèi)標(biāo)法，除了可以定量常見的甘草三萜類代表性成分甘草酸、甘草次酸及黃酮類成分甘草苷外還可同時(shí)定量香豆素類成分甘草香豆素和異甘草酚在內(nèi)的共8 種成分。在以往的甘草質(zhì)量控制有效成分測(cè)定研究中[23,25-26]，尚未見同時(shí)這測(cè)定8 種有效成分的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法穩(wěn)定性強(qiáng)，并有著很高的靈敏度和分辨率，能夠快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地測(cè)定這8 種甘草成分在甘草不同部分及甘草加工食品中的含量，為甘草加工產(chǎn)品的工藝研究提供了重要的參考依據(jù)，為甘草藥材、成藥及相關(guān)食品的質(zhì)量控制提供了新的定量方法。

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Simultaneous Quantification and Comparison of 8 Components in Different Parts of Glycyrrhiza uralensis Using Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Mass Spectrometry

YE Ri-gui1, GAO Jie1, WANG Bing1, LI Er-hu1, ZHANG Yan1, JIANG Fei1, CAO Rui1, HATTORI Masao2, WANG Shi-ming3, MA Chao-mei1,*
(1. School of Life Sciences, Inner Mongolia University, Huhhot 010021, China; 2. Institute of Natural Medicine, University of Toyama, Toyama 2630 930-0194, Japan; 3. Erdos Lan Yuan Materia Medica Co. Ltd., Erdos 150600, China)

An ultra-high-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-QQQMS) with dynamic multiple reaction mode was developed to simultaneously quantify 8 constituents including 22-hydroxyglycyrrhetinic acid, 3-epi-glycyrrhetinic acid, glycyrrhetinic acid, glycyrrhizic acid, liquiritin, glycycoumarin, formononetin and isoglycyrol in Glycyrrhiza uralensis. Cholic acid and abrusin 2”-O-β-apioside were used as the internal standards for triterpenoid and phenolic components, respectively. The internal standards were added to methanol before being used to extract samples. The separation was performed on an Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18column (50 mm × 2.1 mm, 1.8 μm) with methanol-0.1% formic acid as the mobile phase at a flow rate of 0.4 mL/min. As a result, the linear ranges of 22-hydroxy-glycyrrhetinic acid, 3-epi-glycyrrhetinic acid, glycyrrhetinic acid, glycyrrhizic acid, liquiritin, formononetin, isoglycyrol and glycycoumarin were 0.048 8-12.500 0, 0.048 8-12.500 0, 0.012 2-12.500 0, 0.048 8-50.000 0, 0.048 8-50.000 0, 0.012 2-12.500 0, 0.012 2-15.000 0 and 0.195 2-12.500 0 μg/mL, respectively, with correlation coefficients higher than 0.99. The average recovery rate of the developed method ranged from 97.2% to113.0% and the intra-day and inter-day relative standard deviations (RSDs) were 2.63%-4.47% and 1.75%-3.72%, respectively. This method is sensitive, simple, fast, and accurate, and can be used for the quality control of different parts of Glycyrrhiza uralensis and related food products.

Glycyrrhiza uralensis; different parts of Glycyrrhiza uralensis; ultra-high-performance liquid chromatographytriple quadrupole mass spectrometry (UPLC-QQQMS); simultaneous determination

O652.1

A

1002-6630（2014）20-0242-06

10.7506/spkx1002-6630-201420048

2013-11-27

內(nèi)蒙古大學(xué)本科生創(chuàng)新基金項(xiàng)目

葉日貴（1989—），女，碩士研究生，主要從事天然藥物與功能食品的成分及藥理作用研究。E-mail：342612067@qq.com

*通信作者：馬超美（1962—），女，教授，博士后，主要從事天然藥物與功能食品研究。E-mail：cmma@imu.edu.cn